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细胞衰老对肿瘤来说是一把双刃剑:一方面,细胞衰老可以清除体内损伤细胞或癌基因异常激活的细胞从而防止细胞的癌变;而另一方面,衰老细胞容易导致不利突变,端粒功能异常导致细胞基因组紊乱,以及衰老细胞中微环境的改变等因素都有利于肿瘤的发生。因而,了解衰老与肿瘤之间的关系对延缓衰老以及肿瘤的预防和治疗是非常有意义的。人类早老综合症(Werner syndrome,WS)是研究衰老与肿瘤之间关系的一个经典模型。由于WS小鼠模型中敲除了端粒酶基因,因而这一小鼠中产生的肿瘤是端粒酶非依赖型的,使用端粒延长替代机制(Alternative Lengthening of Telomere,ALT)来维持端粒的长度和功能。前期研究发现该小鼠的G5代MEF细胞出现衰老,而部分细胞逃逸衰老,形成永生化细胞系(395-3B-1、395-3B-2、395-9B-1、395-6B-1、395-7A-1、395-7A-3),其中 395-3B-1、395-3B-2、395-9B-1等细胞系能够在SCID小鼠体内形成ALT肿瘤。而这些ALT肿瘤细胞中p16基因的启动子区域CpG岛高度甲基化。然而,当这些细胞过表达外源的p21后,DNA甲基化酶1(DNAmethyltransferase,DNMT1)的表达显著降低,导致p16去甲基化重新表达,诱导肿瘤细胞进入衰老状态。同时发现p21诱导了 miR-185以及miR-152的表达升高,可能直接靶向DNMT1的mRNA,并抑制其表达,但其机制尚不清楚。基于上述研究基础本研究主要分为两个部分,第一部分:在ALT肿瘤细胞中过表达外源p21,进一步研究p21诱导DNMT1表达降低的分子通路;第二部分:通过在ALT肿瘤细胞中过表达miR-185以及miR-152 mimics,进一步研究两个miRNA对p16甲基化的作用。我们以395-9B-1细胞为实验材料,在此细胞中过表达p21。用蛋白免疫印迹的方法对DNMT1转录因子Sp1和E2F1的检测发现,p21过表达降低了 Sp1和E2F1蛋白水平表达。这个结果表明,p21可能通过调控转录因子Sp1和E2F1的表达,从而抑制其下游靶基因DNMT1的表达。众所周知,p21作为一种重要的周期蛋白抑制因子可以通过对细胞周期蛋白激酶的抑制进一步抑制E2F的释放。E2F作为一种转录因子参与调控多种基因的表达。而我们发现在ALT肿瘤细胞中过表达p21后可以直接抑制E2F1的表达。证明p21不仅参与了 E2F的功能调控,同时还参与了 E2F1的表达调控。另一方面,我们在395-9B-1细胞中转染miR-185、miR-152 mimics来过表达这两种miRNAs,以进一步研究这两个miRNAs对细胞的影响。我们发现两个miRNA都可以显著降低DNMT1的表达,且DNMT1在蛋白水平的降低相对于mRNA水平更为显著。进而诱导p16的去甲基化,导致P16重新表达。这些数据提示我们,miR-185、miR-152对DNMT1表达的调控可能主要是通过在蛋白水平调控DNMT1,如翻译调控或蛋白降解的调控,也同时通过调控其mRNA的转录来共同实现的。由于组蛋白的修饰与基因甲基化修饰以及基因表达调控密切相关,为了进一步了解miR-185、miR-152对p16甲基化修饰的调控机制,我们通过Westernblot技术对转染miR-185、miR-152后组蛋白H3K4me3和H3K27me3的表达进行检测。结果发现过表达miR-185、miR-152,可以明显上调H3K4me3的表达。据此,我们推测,表达上调的H3K4me3可以抑制DNMT3L与核小体的结合,进一步抑制DNMT3A和DNMT3B的甲基化功能,从而导致p16去甲基化,促使p16的重新表达。并且研究中我们发现:共转染miR-185和miR-152可以抑制H3K27三甲基化修饰的形成。而在单独转染miR-185或者miR-152的细胞中却未发现这一现象。这一结果表明,miR-185和miR-152之间存在一种协同作用可以抑制H3K27me3的表达,解除对p16的转录抑制。此外,对p21蛋白的表达检测显示,miR-185和miR-152对p21的蛋白表达有一定的反馈促进作用。鉴于p16、p21都是重要的细胞周期抑制因子,我们对这些细胞进行细胞周期检测。出乎我们的预料,在过表达miRNA mimcs的细胞中,虽然p21、p16表达升高,但是其S期却明显增长,细胞周期加快。为了解释这一现象,我们对周期蛋白激酶CDK4、CDK6进行检测,发现两个周期蛋白激酶在蛋白水平都有一定程度的升高。这一现象有待进一步的研究证实。此外,研究中我们还意外发现,阳离子脂质体转染试剂lipo2000会影响395-9B-1细胞中DNMT1蛋白的表达。为了进一步研究lipo2000对细胞中DNMT1表达的影响,我们以Hela细胞为实验材料进行进一步的验证。结果发现lipo2000处理在转录后水平抑制Hela细胞中DNMT1的表达,而后期Hela细胞通过提升其转录水平来恢复DNMT1的蛋白表达量。并且不同浓度的lipo2000对DNMT1的影响不一样。相对于高浓度lipo2000处理,低浓度的lipo2000对Hela细胞中DNMT1的表达影响更明显,但是持续时间相对较短。综上所述,我们的数据表明,在ALT肿瘤395-9B-1细胞中过表达p21,通过下调DNMT1的转录因子Sp1、E2F1来抑制DNMT1的表达,从而促使p16的去甲基化。而过表达miR-185、miR-152可以通过下调DNMT1,来促使p16的去甲基化。并且两个miRNAs可上调H3K4me3的表达,进一步抑制DNMT3A和DNMT3B的甲基化功能。同时miR-185和miR-152之间存在一种协同作用可以抑制H3K27三甲基化(H3K27me3)修饰的形成,进一步促进p16转录。此外,miR-185、miR-152还可上调CDK4、CDK6的表达。这也提示我们一种miRNA可能在多条通路以及多种生命活动中发挥作用,并且miRNAs之间可能还存在着复杂的相互作用。p16作为一种重要的抑癌基因在肿瘤的发生过程中,常表现为高甲基化而失活的状态。研究发现p21以及miR-185、miR-152在p16表观遗传学修饰调控中发挥了重要作用,为相关的肿瘤防治提供了一个新的方向。