研究背景:近年来,麻醉药物对婴幼儿神经系统的毒性作用得到了广泛的社会关注。妊娠末3个月至出生后2-3年,是人类神经系统的快速发育期,在此期间未成熟神经系统对毒性因子异常敏感。动物研究已证实多种麻醉药物在此期间可以对发育期大脑产生毒性作用。七氟烷作为常用的吸入性全麻药物之一,由于其特有的理化特性,被广泛应用于儿科麻醉的诱导及维持。目前有研究证实接受反复七氟烷麻醉的动物幼崽可以在其成年后表现出学习能力缺陷和异常的社交行为,但具体作用机制仍未完全阐明。在大样本临床回顾性研究中,麻醉药物是否会对婴幼儿神经系统造成损伤依然存在争议,这可能与麻醉药物种类、剂量、作用时间与次数以及脑发育所处的状态均相关。另外,有实验研究发现神经系统中包含了丰富的miRNA,其与神经系统发生和发育、神经干细胞分化、突触发生、树突棘形成等息息相关。本实验首先通过临床观察,研究短时间七氟烷麻醉是否会对腭裂患儿脑发育产生影响。接着通过细胞及动物学实验研究miR-27a-3p/PPARγ信号通路在反复七氟烷麻醉致脑发育期海马神经元凋亡中的作用,以期回答七氟烷是否会对发育期大脑产生毒性作用及其具体作用机制。本实验共分为四部分:第一部分单次短时程七氟烷麻醉对婴幼儿脑发育影响的初步研究目的:观察单次短时程七氟烷麻醉对婴幼儿神经系统发育的影响。方法:将月龄小于18个月,需接受腭裂手术的患儿作为研究对象。采用七氟烷作为唯一全麻诱导及维持用药。以患儿自身作为参照,比较手术前后血浆NSE、S-100β水平以及术前,术后6个月、18个月第二版贝利婴幼儿发展量表（BSID-II）评分。结果:共有101名患儿完成了6个月随访,其中86名患儿完成了18个月随访。手术前后血浆NSE、S-100β以及BSID-II评分未发现具有统计学差异。结论:单次短时程（小于2小时）七氟烷麻醉对婴幼儿中枢神经系统发育未发现存在明显的负面影响,但其远期效应仍有待进一步考证。第二部分小鼠原代海马神经元培养与纯度鉴定目的:通过体外培养小鼠原代海马神经元并进行纯度鉴定,为进一步研究七氟烷致海马神经元凋亡的作用机制奠定基础。方法:取孕14天C57BL/6小鼠胎鼠的海马组织进行体外细胞原代培养。利用显微镜进行细胞形态学观察,通过免疫荧光细胞化学法（βIII tubulin抗体和DAPI双荧光染色）鉴定所培养的小鼠神经元纯度。结果:体外细胞培养所获得的小鼠原代海马神经元纯度为94.3±1.9%。结论:本部分实验成功获取了小鼠原代海马神经元并完成了体外细胞培养,通过鉴定得到了较高纯度的海马神经元,为后续进一步实验奠定了扎实的基础。第三部分miR-27a-3p/PPARγ对七氟烷所致小鼠海马神经元细胞损伤的调节作用目的:通过体外细胞学实验研究miR-27a-3p/PPARγ对七氟烷所致小鼠海马神经元细胞损伤的调节作用。方法:将体外培养至第7天的小鼠原代海马神经元细胞随机分为4组:空白对照组（Control组）、4%七氟烷组（4%Sevo组）、4%七氟烷+miR-27a-3p抑制剂组（4%Sevo+inhibitor组）、4%七氟烷+罗格列酮组（4%Sevo+RSG组）。罗格列酮处理浓度为5μM,七氟烷处理时间为6h。通过流式细胞仪检测神经元细胞凋亡率,利用DHE荧光探针检测细胞内ROS含量,western blot技术检测NOX1和NOX4蛋白表达水平,realtime PCR技术检测各组miR-27a-3p表达水平,ELISA法检测培养基上清液IL-6、IL-1β及TNF-α含量。并用双荧光素酶检测miR-27a-3p和PPARγ之间靶向作用关系。结果:与Control组相比,4%Sevo组处理神经元细胞6h后可使细胞凋亡率、细胞内ROS含量、miR-27a-3p、NOX1和NOX4表达水平、以及炎症因子IL-6、IL-1β及TNF-α释放均增加。加入miR-27a-3p抑制剂或罗格列酮后可以部分抑制这些改变,但罗格列酮处理后并不能抑制七氟烷诱导的神经元细胞内miR-27a-3p表达的增高。此外,miR-27a-3p和PPARγ之间具有靶向作用关系。结论:miR-27a-3p/PPARγ信号通路介导了七氟烷所致的小鼠海马神经元细胞损伤作用,其作用部分是通过增加了氧化应激及炎症反应。第四部分miR-27a-3p/PPARγ在七氟烷麻醉致小鼠脑生长爆发期海马神经细胞损伤中的调节作用目的:通过动物在体实验验证miR-27a-3p/PPARγ信号通路在七氟烷麻醉致小鼠脑生长爆发期海马神经细胞损伤中的调节作用。方法:将出生6天的幼鼠随机分为4组:对照组（Control组）、simiR-27a-3p组（Si RNA组）、七氟烷麻醉组（Sevo组）、simiR-27a-3p+七氟烷麻醉组（Si RNA+Sevo组）,七氟烷麻醉为2.2%浓度,每天2小时,共持续3天。在出生后第10和第45天,用TUNEL法检测各组海马区神经细胞凋亡水平,DHE荧光探针检测ROS含量,用realtime PCR技术检测各组miR-27a-3p表达水平,Western blot技术检测PPARγ蛋白表达水平,ELISA法检测海马组织匀浆中IL-6、IL-1β及TNF-α含量。待成年后通过Morris水迷宫比较各组小鼠学习记忆能力。结果:与Control组相比,多次七氟烷麻醉可以使小鼠海马区细胞凋亡增加,miR-27a-3p、ROS的表达量增加,PPARγ蛋白表达水平下降,炎症因子IL-6、IL-1β及TNF-α释放增加,并可以使小鼠成年后学习记忆能力下降。通过对miR-27a-3p的干扰,可以部分抑制上述改变,改善多次七氟烷麻醉后学习记忆能力。结论:反复七氟烷麻醉可以上调小鼠海马区miR-27a-3p的表达,后者靶向抑制PPARγ蛋白水平的表达,通过增强氧化应激及炎症反应,导致小鼠成年后学习记忆能力下降。