羰基还原酶的筛选及其在瑞舒伐他汀手性中间体合成中的应用

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(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯(tert-butyl(3R,5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoate,(3R,5S)-CDHH)是一种重要的医药手性中间体,主要用于降血脂药物瑞舒伐他汀手性侧链的合成。目前,利用生物法催化合成(3R,5S)-CDHH颇受研究者关注,研究(3R,5S)-CDHH生物法生产工艺、提高生物法生产效率有着重要的应用前景。本论文首先从羰基还原酶的筛选入手,通过基因挖掘技术及实验室保藏的羰基还原酶基因工程菌,获得Escherichia coli BL21(DE3)/p ET-28b-SCR1菌株。并将其用于(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯(tert-butyl(S)-6-chloro-5–hydroxy-3-oxohexanoate,(S)-CHOH)还原的不对称还原反应中,催化得到产物(3R,5S)-CDHH,d.e.>99%。以E.coli BL21(DE3)/p ET-28b-SCR1为出发菌株,优化确立其最佳发酵条件:蛋白胨15 g/L,酵母粉12 g/L,Na Cl 10 g/L,(NH42SO45 g/L,甘油15 g/L,KH2PO4 1.36 g/L,K2HPO4·3H2O 2.28 g/L,Mg SO4·7H2O 0.375 g/L,pH 7.0,灭菌后补加终浓度为50μg/mL的卡那霉素。菌体接种量10%,于37?C、150 rpm培养2 h后加入终浓度10 g/L的乳糖进行诱导,诱导条件为28?C、150 rpm、8 h。50 L发酵罐菌体量达到12.70 g DCW/L,体积酶活达到152104.60 U/L,比酶活达到11976.70 U/g DCW;500 L发酵罐菌体量达到9.70 g DCW/L,体积酶活达到152774.50 U/L,比酶活达到15749.95 U/g DCW;5000 L发酵罐菌体量达到10.97 g DCW/L,体积酶活达到210735.07 U/L,比酶活达到19210.12 U/g DCW,发酵罐分批发酵各批次菌体生长及产酶趋势基本一致。系统考察了反应条件对重组工程菌的影响,建立了异丙醇共底物辅酶循环催化体系。结果表明重组工程菌在30?C,40%(v/v)异丙醇,10 g DCW/L全细胞体系条件下,能够高效催化400 g/L(S)-CHOH合成(3R,5S)-CDHH。在最优条件下,进行5000 L反应釜全细胞催化合成(3R,5S)-CDHH反应的放大。反应时间12 h,(3R,5S)-CDHH产率和d.e.值分别达到97.5%和99%。在无外源辅酶添加的情况下,产物浓度达到了1648 mM,单位菌体时空产率达到13.7 mM/h/g DCW,为目前报道最高值,对反应所得产物(3R,5S)-CDHH进行分离纯化得到琥珀色最终产品,总收率达84.4%。
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