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目的:体外实验观察单独或联合应用柴胡皂苷D(Saikosaponin D,SSd)和JNK抑制剂SP600125对骨肉瘤U-2OS细胞株生物学行为的影响及作用机制。方法:1.用SSd和SP600125(0μM SSd/2μl DMSO;5μM、10μM、20μM SSd;20μM SP600125;5μM SSd+20μM SP600125;10μM SSd+20μM SP600125;20μM SSd+20μM SP600125)分别处理骨肉瘤U-2OS细胞12,24和36小时后,使用划痕实验测定U-2OS细胞的迁移能力。2.用SSd和SP600125(0μM SSd/2μl DMSO;10μM、20μM SSd;20μM SP600125;10μM SSd+20μM SP600125;20μM SSd+20μM SP600125)分别处理骨肉瘤U-2OS细胞24,36和48小时后,使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)实验测定U-2OS细胞的增殖。3.用SSd和SP600125(0μM SSd/2μl DMSO,20μM SSd,20μM SP600125,20μM SSd+20μM SP600125)处理骨肉瘤U-2OS细胞24小时后,使用Hoechst33258染色在荧光显微镜下观察骨肉瘤U-2OS细胞形态的变化。4.将对数生长期骨肉瘤U-2OS细胞随机分为以上4组,相应药物作用24小时后,应用流式细胞术检测各组细胞凋亡率。5.将对数生长期骨肉瘤U-2OS细胞随机分为以上4组,相应药物作用24小时后,应用Transwell实验测定U-2OS细胞的侵袭能力。6.将对数生长期骨肉瘤U-2OS细胞随机分为以上4组,相应药物作用24小时后,应用Western blot技术分析各组细胞AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2、Mcl-1、Bax、Bcl-2、Cytochrome C、caspase-3、caspase-8、caspase-9、PARP蛋白水平的表达变化。结果:1.与对照组中的细胞(2μl DMSO)相比,用5μM、10μM、20μM SSd,20μM SP600125,5μM SSd+20μM SP600125,10μM SSd+20μM SP600125,20μM SSd+20μM SP600125处理骨肉瘤U-2OS细胞36小时后,细胞迁移抑制率分别为:6.18%、11.95%、44.64%、11.50%、22.52%、29.70%、49.10%。结果表明单独或联合应用SSd和SP600125可显著抑制骨肉瘤U-2OS细胞的迁移能力(P<0.05)。2.与对照组中的细胞(2μl DMSO)相比,用10μM、20μM SSd,20μM SP600125,10μM SSd+20μM SP600125,20μM SSd+20μM SP600125处理骨肉瘤U-2OS细胞24小时后的细胞存活率分别为72.22%、50.15%、86.73%、60.01%、42.51%。结果表明联合应用SSd和SP600125比单独使用这两种药物对U-2OS的增殖的抑制作用更明显,单独应用SSd比单独应用SP600125对U-2OS细胞增殖的抑制作用更明显。3.用SSd和SP600125(0μM SSd/2μl DMSO,20μM SSd,20μM SP600125,20μM SSd+20μM SP600125)处理骨肉瘤U-2OS细胞24小时后,发现20μM SSd组和20μM SSd+20μM SP600125组在用Hoechst 33258染色的U-2OS细胞中显示出了浓缩和破碎的细胞核,这是凋亡细胞的典型形态学特征。4.SSd、SP600125单独及联合作用于骨肉瘤U-2OS细胞后细胞凋亡率改变:24小时后,对照组细胞凋亡率(早期和晚期的凋亡总和)为3.54±0.44%,而20μM SSd组,20μM SP600125组和20μM SSd+20μM SP600125组的细胞凋亡率分别增加至19.24±0.53,4.81±0.25和22.54±1.41。结果表明单独SSd或联合应用SP600125可提高U-2OS细胞凋亡率(P<0.05)。5.用SSd和SP600125(0μM SSd/2μl DMSO,20μM SSd,20μM SP600125,20μM SSd+20μM SP600125)处理骨肉瘤U-2OS细胞24小时后,Transwell实验发现20μM SSd组和20μM SSd+20μM SP600125组中侵入基质胶涂层的Transwell室膜的细胞数量显著减少(P<0.05),而20μM SP600125组与对照组相比无统计学意义(P>0.05)。6.单独或联合应用SSd和SP600125作用于骨肉瘤U-2OS细胞后对AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2、Mcl-1、Bax、Bcl-2、Cytochrome C、caspase-3,caspase-8、caspase-9、PARP蛋白表达的影响:SSd单独应用及联合SP600125作用可增强Cytochrome C释放,增加Bax/Bcl-2比率,并激活caspase-3,-8和-9,表明可通过线粒体和死亡受体途径诱导细胞凋亡(P<0.05)。单独应用SP600125对U-2OS细胞的影响不显着(P>0.05)。此外,Mcl-1、Akt、p-Akt、ERK1/2、p-ERK1/2的表达情况支持了SSd的抗肿瘤作用和其联合SP600125对骨肉瘤U-2OS细胞的协同抗肿瘤作用。结论:1.单用SSd对骨肉瘤U-2OS细胞能产生显著的抗肿瘤作用,而单用SP600125对骨肉瘤U-2OS的抑制作用不明显。2.两种药物对骨肉瘤U-2OS细胞具有协同抗肿瘤作用,为SSd与SP600125联合治疗骨肉瘤提供了理论依据。