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小尾寒羊是世界上具有非季节性发情和多胎特性的高繁殖力绵羊品种之一,揭示小尾寒羊多胎的分子生物学调控机制,无论对于小尾寒羊的选育及有效利用,还是弄清绵羊排卵率多样性产生的分子基础,并选择准确、直观的标记以用于MAS(Marker assisted selection)均具有重要的理论意义和应用价值。 本课题组采用SMART技术在国内外首次成功构建了高质量的小尾寒羊卵巢组织cDNA文库,该文库的原始容量为5×10~6,重组率达到96%以上,扩增后库的滴度达1×10~9 pfu/ml,文库中插入片段大小分布在0.5～5.0kb之间,平均长度为1.5kb左右。 本研究在前期成功构建小尾寒羊卵巢组织cDNA文库的基础上,利用最新的生物信息数据资料,采用同源克隆的策略,以已知其他物种与排卵率相关基因片段标记的探针对小尾寒羊发情期卵巢组织cDNA文库进行筛选、克隆,获得小尾寒羊卵巢组织特异表达的与排卵有关的基因EST,从而得到小尾寒羊与繁殖性状相关的新的候选基因。试验结果表明与排卵有关的抑制素基因、卵泡刺激素受体基因、雌激素受体基因、前列腺素基因、转化生长因子β基因和表皮生长因子基因等均可以从小尾寒羊卵巢cDNA文库中筛选到相应的同源基因。这充分说明利用同源克隆的策略从文库中寻找候选基因是一条快捷、有效的办法,为最终找到影响或控制排卵性状的主效基因奠定了基础。 利用DNAstar分析软件中的EditSeq程序和NCBI提供的ORF Finder软件,对核酸序列的ORF进行分析。在分析克隆全长插入序列时,通过互联网在线分析可发现有完整开放阅读框及部分5’和3’端非编码序列,则确定为全长cDNA。但这只是计算机分析结果,是否是具有生物学意义的全长cDNA还需要试验进一步验证。 大量资料表明,150bp～400bp长度的核苷酸片段包含了cDNA序列鉴