研究背景过敏反应(anaphylaxis)是机体受到同一抗原再次刺激后突然发生的一种严重的、可致命性的、系统性的、免疫活性物质介导的高敏反应。过敏反应死亡(anaphylactic death),指发生过敏性反应导致的突然死亡。引起过敏反应死亡的原因,主要为过敏性休克,其他还有喉头水肿、支气管痉挛、肺水肿血管性水肿等。过敏性反应属于Ⅰ型变态反应(type I hypersensitivity reaction),是机体再次受到同一变应原刺激,引起体内已经结合特异性IgE的高敏状态的肥大细胞和嗜碱性粒细胞等细胞主动脱颗粒,从而分泌一系列的具有生物活性的化学介质(如组胺、白三烯、前列腺素、血小板活化因子、嗜酸性粒细胞趋化因子等)和酶(如类胰蛋白酶、类糜蛋白酶、髓过氧化物酶等),同时多种细胞因子(如IL-4、IL-5、 IL-6、TNF-a等)也从细胞释放出来,上述介质、酶和细胞因子作用于效应组织可引起毛细血管通透性增强、小血管扩张、平滑肌收缩、腺体分泌增加及嗜酸性粒细胞增多和浸润等,从而使有效血容量减少导致休克发生,喉头水肿、支气管收缩使呼吸道狭窄导致窒息。速发型的过敏反应是临床常见的急症之一,发病突然,难以预见,常危急生命。当前美国流行病学调查资料显示,每年约有1500人死于过敏反应,过敏反应的终身患病率约在0.05%-2.0%之间,而且并未包括未记录的、未诊断的、诊断错误的病例。我国人群过敏反应的发病率和患病率以及死于过敏反应的人数暂时未有具体的统计数据。法医学鉴定实践中,过敏反应死亡尸检时并无特异性的病理形态学改变,要做出过敏性急死的法医学鉴定诊断,必须在排除自身性疾病、中毒及其他暴力性死亡原因的基础上,结合过敏原接触史、临床症状、病理学资料和实验辅助检查资料才可做出诊断。近年来,国内外学者对血清总IgE、组胺、肥大细胞类胰蛋白酶、类糜蛋白酶、白三烯、血栓素B2、P物质等于过敏反应的关系做不少研究,关于上述物质在体外保存条件下的稳定性研究也有不少,然而由于死后尸体内存在细胞溶解和化学降解,上述物质在死后尸体血液中的稳定性和含量可能有所变化。目的法医尸体解剖一般在死后一天到数天不等,那么过敏反应死亡血清中过敏反应相关指标的死后变化如何?有报道类胰蛋白酶在非过敏反应死亡(如严重外伤或心肌梗死)的尸体血清中含量随死亡时间延长有增加的趋势。有研究显示过敏反应死亡豚鼠在冷冻的条件下,48h内血清和肺组织中IgE随死后时间延长无明显变化。国内外研究多为室温保存下体外或低温保存下体内血清中相关指标的研究,而在室温条件下尸体血液或组织中的IgE、类胰蛋白酶和类糜蛋白酶浓度随死亡时间变化的研究未见系统报道。前期实验参照混合人血清诱发豚鼠过敏反应死亡模型并适当改良,通过观察动物行为反应、病理学技术和ELISA测定血清总IgE和类胰蛋白酶含量证实过敏反应死亡豚鼠模型的成功建立。在成功建立动物模型的前提下,利用ELISA测定豚鼠血清内IgE、类胰蛋白酶和类糜蛋白酶的含量,探讨IgE、类胰蛋白酶和类糜蛋白酶在室温条件下豚鼠过敏反应死亡后24h内的变化情况。方法1、混合人血清诱发豚鼠过敏反应死亡模型的改良和过敏反应行为的观察清洁级雄性豚鼠,共74只,体重250-300g,室温(24±2)℃,相对湿度为40%-50%,分笼饲养,给予标准饲料和饮用水,每天12h日光灯照明,昼夜循环。将豚鼠随机分成原模型实验组25只和8只阴性对照组,改良模型实验组25只、8只阴性对照组和8只非致敏对照组。豚鼠适应性饲养一周后注射过敏原致敏。原模型实验组豚鼠后爪掌皮内注射过敏原0.15ml,致敏并置于室温环境下饲养3周后,心内注射1ml过敏原稀释液,诱发过敏反应,阴性对照组以0.9%的生理盐水代替过敏原,方法和剂量同实验组。改良模型实验组豚鼠分别在第1天和第3天在豚鼠双侧后爪掌皮内注射过敏原各0.1ml,阴性对照组和非致敏对照组以0.9%的生理盐水代替,方法、剂量同改良模型组,第二次皮内注射过敏原并室温环境下饲养2周后,足背静脉注射1ml稀释的过敏原,诱发过敏反应,阴性对照组同种方式注射等量的生理盐水,非致敏对照组同种方式注射等量的过敏原稀释液。两模型实验组未发生死亡的豚鼠和所有对照组观察12h后均颈椎脱臼处死。建模过程中观察原模型实验组、改良模型实验组和各对照组豚鼠的行为表现,豚鼠死后进行解剖,观察器官大体改变并用HE染色观察豚鼠喉头、气管、肺和胃肠道的病理学改变,利用ELISA测定实验组和对照组豚鼠血清总IgE和类胰蛋白酶含量。2、ELISA测定室温条件下体外保存血清、豚鼠尸体内血清及肺脏和胃壁组织总IgE、类胰蛋白酶和类糜蛋白酶含量变化。(1)室温环境下体外保存的血清中IgE、类胰蛋白酶和类糜蛋白酶含量测定：0h实验组解剖动物所得的全部血液静置至凝固后离心取出血清,每例血样本均分成4份,其中一份作为0h的血清样本保存于-80℃至检测使用,另外3份存放于室温环境下,并分别放置1d、2d和3d后测定血清总IgE、类胰蛋白酶和类糜蛋白酶的含量。(2)豚鼠尸体内血清中总IgE、类胰蛋白酶和类糜蛋白酶含量测定：114只豚鼠随机分成Oh、2h、4h、8h、12h和24h6个时间组,每个时间组分为11只实验组和8只对照组。全部豚鼠死亡后均在室温环境下置于定制的含丝网的盒子,按时间分组进行动物解剖并取血,应用酶联免疫吸附法(ELISA)测定24h内豚鼠血清总IgE、类胰蛋白酶和类糜蛋白酶含量的变化。(3)豚鼠肺脏、胃壁组织中的IgE、类胰蛋白酶和类糜蛋白酶含量：改良模型实验组和对照组0h的6对豚鼠解剖后分别取部分肺脏和胃壁组织称重并用生理盐水清洗干净,反复冻融4次后于-80℃冷冻保存备用。实验前器官组织解冻,每份组织精确称重并加适量蒸馏水后研磨匀浆,离心后取上清,ELISA测定肺脏和胃壁组织中IgE、类胰蛋白酶和类糜蛋白酶的含量。结果1、18只改良模型实验组组豚鼠和13只原模型实验组豚鼠在注射过敏原后相对安静,1min左右逐渐出现甩头、打喷嚏,前爪搔抓鼻部及头部,四肢肌肉抽搐偶尔出现蹦跳,出现身体平衡性下降后侧倒在地,呼吸急促,鼻尖部皮肤及口唇周围粘膜发绀,口腔、鼻腔水样分泌物增多,出现深大呼吸,部分豚鼠出现二便失禁,最后呼吸停止,心跳维持跳动数分钟后停止。改良模型实验组出现反应的时间相对原模型实验组推迟4min左右。2只改良模型实验组和1只原模型实验组豚鼠过敏反应症状轻微,约20min后恢复正常。改良模型实验组豚鼠过敏反应死亡发生率为75%,而原模型实验组为54.2%。发生过敏反应死亡的豚鼠,镜下可见喉头水肿,严重肺气肿,全身脏器淤血,大部分豚鼠喉头、气管、支气管及胃肠粘膜下可见较多嗜酸性粒细胞浸润；原模型实验组及其对照组全部出现心包积血,5只豚鼠发生严重心包填塞死亡。原模型实验组与阴性对照组血清总IgE含量比较,P>0.05,认为两者无统计学差异,原模型实验组与改良模型实验组血清总IgE含量比较有统计学差异(F=16.68,P<0.001)；改良模型实验组与原模型实验组血清类胰蛋白酶含量比较有统计学差异(F=18.268,P<0.001),即改良模型实验组血清类胰蛋白酶含量升高的更明显(1.913>1.088μg/L)。2、(1)0h实验组豚鼠血清于体外室温环境放置,血清总IgE含量在0d、1d、2d、3d的含量比较,F=0.386,P=0.764>0.05,可认为组间差异无统计学意义；3天内血清肥大细胞类胰蛋白酶含量比较,F=0.005,P=0.999>0.05,组间差异无统计学意义；3天内血清肥大细胞类糜蛋白酶含量比较,F=0.145,P=0.932>0.05,组间差异无统计学差异。(2)实验组和对照组血清总IgE含量比较,F=35.146,P<0.001,可认为两者有统计学差异；24h内不同死亡时间组血清总IgE含量比较没有统计学差异(F=0.575,P=0.719>0.05),组间两两比较,P值均大于0.05。实验组和对照组血清类胰蛋白酶含量比较,F=98.444,P<0.001,可认为两者差异有统计学意义；24h内实验组不同死亡时间的血清类胰蛋白酶含量比较有统计学差异,(F=2.881,P=0.018<0.05),而对照组不同死亡时间的比较没有统计学差异(F=0.892,P=0.496>0.05)；实验组0h组和8h组之间比较,P<0.05,其余时间组组间两两比较,P值均大于0.05。实验组和对照组血清类糜蛋白酶含量比较,F=127.608,P<0.001,可认为两者有统计学差异；24h内不同死亡时间组血清类糜蛋白酶含量比较没有统计学差异(F=0.819,P=0.539>0.05),组间两两比较,P值均大于0.05。(3)过敏反应死亡的豚鼠肺脏组织与对照组肺脏中总IgE含量比较,F=0.173,P=0.686>0.05,可认为两者差异无统计学意义；类胰蛋白酶含量比较,F=31.92,P<0.05,可认为两者差异有统计学意义；类糜蛋白酶含量相比较,F=6.989,P=0.025<0.05,可认为两者有统计学差异。实验组豚鼠胃壁组织与对照组胃壁组织IgE含量比较无统计学差异(F=I.537,P=0.243>0.05)；类胰蛋白酶含量比较,F=0.989,P=0.334>0.05,可认为两者差异无统计学意义；类糜蛋白酶含量比较有统计学差异(F=65.858,P<0.05)。结论1、通过改良致敏方式和致敏时间,成功的提高了豚鼠过敏反应死亡的发生率。改良模型组豚鼠过敏原注射方式为外周静脉注射,避免因心腔注射引起的心包填塞。血清中IgE和类胰蛋白酶含量和原模型组比较有统计学差异,为后续研究血清总IgE、类胰蛋白酶和类糜蛋白酶的死后变化提供更好的实验载体。2、(1)根据室温体外环境下放置的血清中总IgE、肥大细胞类胰蛋白酶和肥大细胞类糜蛋白酶含量的统计学结果,室温体外环境下,尚不能认为3天内血清总IgE、肥大细胞类胰蛋白酶和类糜蛋白酶含量发生明显变化,可见上述指标3天内于室温保存是相对稳定的。(2)室温环境下0h,2h,4h,8h,12h和24h时间段实验组豚鼠体内血清总IgE含量相比较P>0.05,因此尚不能认为24h内室温环境下过敏反应死亡豚鼠体内的血清总IgE含量有差异。从文献上看IgE的生成和消除,血清IgE水平的升高是初次接触过敏原后数星期内的结果,而发生过敏反应并不马上引起已经升高的血清总IgE水平再次升高,存活大鼠的血液循环中IgE的半衰期约为12h,而IgE的主要消除方式是血管内到血管外的重分布,发生过敏反应后没有立即生成IgE,而且死后血管内IgE的重新分布缓慢,加之IgE本身比较稳定,这可能是24h内室温环境下体内血清总IgE含量未有变化的原因。类胰蛋白酶主要存在于肥大细胞的颗粒,除少数其他细胞外(如嗜碱性粒细胞)其他细胞不存在类胰蛋白酶成分,血清类胰蛋白酶水平的升高一般由肥大细胞脱颗粒引起。肺脏和心脏存在大量的肥大细胞,是重要的过敏反应靶器官,发生过敏反应时肺脏和心脏的肥大细胞均可被激活而脱颗粒,使肥大细胞相关介质(类胰蛋白酶、类糜蛋白酶、组胺等)分泌到细胞间质。本实验结果显示室温条件下实验组各时间组组间比较P<0.05,发现心内血的类胰蛋白酶在豚鼠发生过敏反应死后24h内有升高的趋势,而且实验组肺脏类胰蛋白酶含量明显高于对照组(F=31.92,P<0.05),这可能与发生过敏反应过程中大量的类胰蛋白酶分泌到肺脏和心脏的细胞间质以及类胰蛋白酶的死后弥散至心内血有关。类糜蛋白酶也是一种肥大细胞特异的丝氨酸蛋白酶,储存于肥大细胞的分泌颗粒。本实验结果显示实验组和对照组豚鼠血清类糜蛋白酶含量差异有统计学意义(F=127.608,P<0.001),而肺脏组织中类糜蛋白酶含量差异也有统计学意义(F=6.989,P=0.025<0.05),这可能与肺组织中肥大细胞主要为只表达类胰蛋白酶的MCT和类糜蛋白酶的宿主防御功能导致过敏反应发生后血清中类糜蛋白酶进入肺组织抵御外来的过敏原有关。24h内室温条件下过敏反应死亡豚鼠尸体心内血清中类糜蛋白酶含量差异无统计学意义,可能是肺组织中肥大细胞类型主要为MCT,类糜蛋白酶于死后弥散量不大。