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肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是常见恶性肿瘤之一,侵袭性强,死亡率高。由于肿瘤的进展使肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)发生改变,降低抗肿瘤免疫应答,使得肿瘤细胞更容易发生免疫逃逸。因此目前临床上现有的治疗措施均无法达到预期的治疗效果。随着医学技术的进步,免疫治疗在肿瘤治疗研究领域取得优秀的成果。免疫治疗旨在准确选取肿瘤细胞作用靶点,应用靶点对应的抗体作用于肿瘤细胞,改善TME,提升机体抗肿瘤免疫应答,杀伤肿瘤细胞的。CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG oligodeoxynuleotide,CpG-ODN)作为免疫增强剂在HCC治疗研究中多次出现,可作为治疗辅助性用药提升治疗效果,但有研究表明单独应用CpG-ODN对HCC转移瘤治疗无效。4-1BB分子是肿瘤免疫治疗研究中的新型免疫检查点,其对应的激动型抗体对乳腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤及其同源转移瘤有显著的治疗效果。早期有学者在HCC患者肿瘤组织及癌旁组织中均检测到了4-1BB分子的高度表达,并且应用CpG-ODN可促进它的表达。这些研究成果为HCC免疫治疗提供了一种新思路。在本实验中,我们首先建立了小鼠肝细胞癌多发荷瘤模型,并将CpG-ODN与抗4-1BB激动型抗体联合治疗方案用于小鼠模型治疗,监测模型中所有荷瘤的生长情况及小鼠预后情况,并通过检测部分指标的变化来评价小鼠机体抗肿瘤免疫应答效应的提升作用。目的:探讨局部应用CpG-ODN联合抗4-1BB激动型抗体对小鼠HCC多发荷瘤模型的治疗效果,以及对小鼠机体抗肿瘤免疫应答的提升程度。方法:将H22细胞从液氮中取出后进行复苏培养,并调整成浓度为1×107个/ml的细胞悬液。在100只BALB/c雄鼠四肢腋窝皮下注射H22细胞悬液0.2ml,7天后筛选出40只荷瘤体积相近的小鼠,随机分为模型对照组、CpG组、4-1BB组、CpG+4-1BB组,每组10只小鼠。分别于接种荷瘤后的第7、9、11天,在小鼠左下肢荷瘤处进行瘤内注射给药,模型对照组给予生理盐水10μl,CpG组每只小鼠给予CpG-ODN 60μg/10μl,4-1BB组每只小鼠给予抗4-1BB单抗60μg/10μl,CpG+4-1BB组每只小鼠给予CpG-ODN 60μg/10μl和抗4-1BB单抗60μg/10μl。选取10只同批正常小鼠作为正常对照组进行部分检测指标的比较。在接种荷瘤后的第7天给药前测量四组小鼠(除正常对照组)荷瘤的长径与宽径,从第9天开始每4天测量1次,比较荷瘤体积的变化。用流式细胞术检测五组小鼠脾脏CD8+T淋巴细胞和CD4+CD25+Foxp3+调节性T淋巴细胞(regulatory T cells,Tregs)在脾淋巴细胞中所占比例。用ELISA法检测五组小鼠血清中白介素-12(interleukin-12,IL-12)和γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)的浓度。称重各组小鼠(除模型对照组)心、肺、肝、肾脏器重量并计算各脏器系数。用CCK-8法检测效/靶比分别为5:1、25:1和50:1时四组小鼠(除正常对照组)脾脏细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)杀伤活性。观察并记录给药后四组小鼠(除正常对照组)生存状态及存活时间,比较生存率差异。采用统计软件SPSS19.0进行统计学分析,P<0.05表示差异有统计学意义。结果:1四组小鼠荷瘤体积的比较结果1.1四组小鼠左下肢治疗处的荷瘤体积的比较结果模型对照组小鼠荷瘤体积进行性增长,CpG组、4-1BB组和CpG+4-1BB组小鼠荷瘤体积与模型对照组相比均减小(P<0.05),4-1BB组和CpG+4-1BB组小鼠荷瘤体积与CpG组相比均减小(P<0.05),CpG+4-1BB组小鼠荷瘤体积小于4-1BB组(P<0.05)。可见三种治疗方案对治疗处的肿瘤均表现出了较好的治疗效果,其中CpG-ODN与抗4-1BB抗体联合应用后治疗效果更佳。1.2四组小鼠远处未治疗荷瘤体积的比较结果模型对照组和CpG组小鼠远处荷瘤体积均呈进行性增长趋势,差异无统计学意义(P>0.05),说明局部单独应用CpG-ODN对远处荷瘤无治疗效果。而4-1BB组三处未治疗的荷瘤中,仅有个别肿瘤出现生长速度减慢的变化,但与模型对照组和CpG组相比无显著差异(P>0.05),从整体结果来看,未表现出明显的治疗效果。CpG+4-1BB组小鼠荷瘤体积与模型对照组、CpG组、4-1BB组相比均减小(P<0.05)。可见CpG-ODN与抗4-1BB抗体联合应用对远处荷瘤有着较为明显的治疗效果。2五组小鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+Tregs占脾淋巴细胞比例的比较结果与正常对照组相比,模型对照组脾脏CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例升高(P<0.05),肿瘤的产生使机体TME发生改变,从而Tregs的活化也随之增强,促进了肿瘤的进展。与模型对照组相比,CpG组、4-1BB组和CpG+4-1BB组脾脏CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例均下降(P<0.05);与CpG组相比,4-1BB组和CpG+4-1BB组脾脏CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例均下降(P<0.05);与4-1BB组相比,CpG+4-1BB组脾脏CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例有所下降(P<0.05)。二者联合应用可使小鼠抗肿瘤免疫应答得到强化,减弱了Tregs的增值。3五组小鼠脾脏CD8+T淋巴细胞占脾淋巴细胞比例的比较结果与正常对照组相比,模型对照组脾脏CD8+T细胞比例下降(P<0.05),肿瘤的进展改变了TME,降低了CD8+T细胞比例。与模型对照组相比,CpG组、4-1BB组和CpG+4-1BB组脾脏CD8+T细胞比例均升高(P<0.05);与CpG组相比,4-1BB组和CpG+4-1BB组脾脏CD8+T细胞比例均升高(P<0.05);与4-1BB组相比,CpG+4-1BB组脾脏CD8+T细胞比例有所升高(P<0.05)。由于二者联合应用使得小鼠机体抗肿瘤免疫应答得到加强,CD8+T细胞的增值也得到增强。4五组小鼠血清中IL-12和IFN-γ浓度的比较结果与正常对照组相比,模型对照组血清中IL-12和IFN-γ的浓度均下降(P<0.05),可见肿瘤进展使得细胞因子水平降低。与模型对照组相比,CpG组、4-1BB组和CpG+4-1BB组IL-12和IFN-γ血清浓度均升高(P<0.05);与CpG组相比,4-1BB组和CpG+4-1BB组IL-12和IFN-γ血清浓度均升高(P<0.05);与4-1BB组相比,CpG+4-1BB组IL-12和IFN-γ血清浓度有所升高(P<0.05)。可见联合治疗方案使小鼠两种细胞因子分泌显著提高,抗肿瘤免疫效应得到提升。5四组小鼠心、肺、肝、肾脏器系数的比较结果CpG组、4-1BB组和CpG+4-1BB组小鼠各脏器系数与正常对照组相比,差异均无统计学意义,三组之间也无显著性差异(P>0.05)。可见实验中所用干预药物未对小鼠造成免疫相关损伤。6四组小鼠脾细胞CTL杀伤活性的比较结果与治疗前相比,CpG组、4-1BB组和CpG+4-1BB组CTL杀伤活性均有明显升高(P<0.05);4-1BB组和CpG+4-1BB组CTL杀伤活性均高于CpG组,CpG+4-1BB组高于4-1BB组(P<0.05)。体外CTL杀伤实验结果再次证明了两种药物联合使得机体抗肿瘤免疫效应得到改善。模型对照组CTL杀伤活性与治疗前相比差异无统计学意义(P>0.05)。7四组小鼠生存情况的比较结果CpG+4-1BB组小鼠死亡较少,4-1BB组和CpG+4-1BB组生存时间均高于模型对照组和CpG组(P<0.05),CpG+4-1BB组高于4-1BB组(P<0.05),模型对照组和CpG组相比差异均无统计学意义(P>0.05),但CpG组平均生存时间略高于模型对照组。两种药物联合后小鼠生存时间有提高,有效改善预后。结论:1当单独给予CpG-ODN或激动型抗4-1BB单克隆抗体治疗小鼠肝细胞癌模型时,治疗处的荷瘤增长缓慢,但对远处未经治疗的荷瘤无明显的治疗效果,小鼠预后也无明显改善。2将CpG-ODN与抗4-1BB单克隆抗体联合应用治疗小鼠肝细胞癌模型,提高了小鼠机体抗肿瘤免疫应答效应,使治疗处的荷瘤缩小,并可减缓远处未经治疗的荷瘤生长速度,从而延长了小鼠的生存时间。