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刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种人畜共患的细胞内寄生原虫,能够感染几乎所有温血动物的有核细胞。免疫力正常的人感染弓形虫后大多无明显的症状,但免疫缺陷病人感染后易导致严重的弓形虫病甚至死亡。孕妇在妊娠早期初次感染弓形虫会导致流产、胎盘细胞凋亡等;而孕晚期感染一般不引起流产,但发生垂直传播的概率达到80%。妊娠期胎儿对于母体来说相当于一种半同种异体的移植,胎儿能够成功躲避来自母亲的免疫攻击,这得益于妊娠期母亲免疫环境中耐受机制的形成,其中抑制性免疫细胞和分子发挥着重要的调节作用,这有助于母亲全身和局部免疫耐受的形成。调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)是CD4+T细胞中发挥负性调节作用的一群细胞,在维持正常妊娠中起着重要作用。以往研究表明,正常妊娠后小鼠的Treg细胞增多,流产小鼠的Treg细胞数目减少,将正常妊娠小鼠的Treg细胞过继转移给有流产倾向的小鼠,可有效降低流产率。本实验室前期研究发现,弓形虫排泄-分泌抗原(Excreted-Secreted Antigens,ESA)可诱导孕鼠体内CD4+CD25+调节性T细胞凋亡,减少了 Treg细胞数目,从而促进流产的发生。程序性死亡分子(Programmed death-1,PD-1)是主要表达在T、B淋巴细胞上的负性协同刺激分子,在维持正常妊娠中起着重要的作用。有研究表明,Treg细胞是通过表达免疫抑制分子PD-1和分泌细胞因子TGF-β、IL-10来发挥免疫抑制作用。此外,Treg细胞上PD-1表达增加会加强其抑制淋巴细胞活化的能力,从而起到保护胎儿的作用。封闭PD-1,Treg细胞的保护性作用消失,小鼠的流产率增高。有报道雌激素可以抗细胞凋亡并且促进Treg细胞上PD-1的表达,而PD-1+Treg具有更强的免疫负调控能力。雌激素受体敲除鼠体内PD-1的表达和Treg细胞的抑制功能都降低。在弓形虫致病中一个有趣的现象就是:弓形虫感染导致不良妊娠结局与母亲妊娠期间感染弓形虫的时间点有关,孕妇在妊娠早期初次感染弓形虫会导致流产等严重的不良妊娠结局;而孕晚期感染弓形虫一般不会引起流产。但是,其具体的机制尚未阐明。由于Treg细胞的数目和PD-1的表达在维持正常妊娠中具有重要作用,我们希望了解孕鼠在孕早期和孕晚期这两个不同的时间点感染弓形虫后,Treg细胞的数目和PD-1分子表达的变化,以及这种变化是否因为感染的时间点不同而存在差异,同时希望揭示造成这种差异的原因。本研究从体内和体外两方面分别设计实验,希望从Treg细胞的角度入手阐明孕早期、孕晚期感染弓形虫造成不同妊娠结局的原因。具体的实验结果如下:1.小鼠孕早期初次感染弓形虫易诱发流产分别于孕早期和孕晚期使小鼠感染相同数量的弓形虫速殖子,感染3天后剖杀,发现孕早期感染弓形虫的小鼠子宫胎儿吸收和出血现象明显,而孕晚期并没有观察到此现象。HE染色结果显示:孕早期感染弓形虫后母胎界面有明显的充血和炎症细胞浸润现象,而孕晚期感染组母胎界面则无明显变化。2.小鼠孕早期感染弓形虫后母胎界面上Foxp3的表达低于孕晚期分别于孕早期和孕晚期使小鼠感染相同数量的弓形虫速殖子,观察感染3天后其母胎界面上Foxp3的表达。我们观察到孕早期小鼠感染弓形虫后母胎界面上Foxp3的表达低于孕晚期感染小鼠。此外,感染组小鼠母胎界面上Foxp3的表达低于未感染组。3.小鼠孕早期感染弓形虫后CD4+CD25+调节性T细胞凋亡率比孕晚期高,Treg细胞上PD-1的表达前者低于后者分别于孕早期和孕晚期使小鼠感染相同数量的弓形虫速殖子,观察感染3天后其脾脏和腹股沟淋巴结CD4+CD25+调节性T细胞的凋亡率以及PD-1的表达。结果发现:孕早期和孕晚期感染弓形虫后,小鼠CD4+CD25+调节性T细胞的凋亡率均升高,但孕早期明显高于孕晚期。此外,在未感染和感染孕鼠中,孕晚期Treg细胞上PD-1的表达都高于孕早期。4.小鼠怀孕后其体内的雌激素水平逐渐增高正常小鼠经过配种、检栓后,在孕早期、孕中期和孕晚期分别摘眼球取血,检测血清中雌二醇的含量,发现随着妊娠的进程,小鼠的雌激素水平逐渐增高,到分娩前达到高峰。这与人在正常妊娠时雌激素的变化趋势一致。5.雌激素在体外具有拮抗CD4+CD25+调节性T细胞凋亡和诱导Treg上PD-1表达的作用用不同浓度的雌激素刺激小鼠脾脏组织单个核细胞,当雌激素浓度达到10-10 M时,CD4+CD25+调节性T细胞凋亡率下降,Treg细胞上PD-1表达上升。此外,当雌激素受体激动剂浓度达到10-6 M时,其抗ESA诱导的CD4+CD25+调节性T细胞凋亡作用最明显并且Treg细胞上PD-1的表达最高;而雌激素受体阻断剂能有效地封闭雌激素抗CD4+CD25+调节性T细胞凋亡和诱导Treg细胞上PD-1表达的作用。6.通过向非妊娠小鼠皮下连续注射雌激素,可有效抑制弓形虫感染后CD4+CD25+调节性T细胞的凋亡,同时上调PD-1+Treg的比例非妊娠小鼠经过两周雌激素注射后,其体内的雌激素水平达到了孕中期的水平。小鼠感染弓形虫后,脾脏和腹股沟淋巴结中的CD4+CD25+调节性T细胞凋亡率注射雌激素组比未注射雌激素组低,而PD-1+Treg 比例前者比后者高。此外,感染小鼠注射雌激素后脾脏中CD4+CD25+调节性T细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2比例增高,促凋亡蛋白Caspase-3比例降低。这些结果提示,雌激素具有抗CD4+CD25+调节性T细胞凋亡和促进PD-1在Treg细胞上表达的作用。综上所述,孕早期和孕晚期初次感染弓形虫会导致不同的妊娠结局,可能与不同孕期雌激素作用下调节性T细胞的数目和PD-1的表达差异有关。研究结果初步揭示了孕早期感染弓形虫更易发生流产的免疫学机制,即CD4+CD25+调节性T细胞凋亡率更高,调节性T细胞数目更少,具有免疫抑制功能的PD-1+Treg细胞比例更低。这有助于认识弓形虫感染导致流产的原因及机制,为临床预防和治疗弓形虫导致的不良妊娠结局提供一定的参考。