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目的 本课题以人白细胞介素-4（白介素-4，Interleukin-4，IL-4），粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)为模型细胞因子，建立并优化人源性细胞因子的组合，并在真核细胞中稳定性表达重组蛋白及其活性研究，这为多细胞因子在体外能够共同表达提供了实验素材和理论参考。构建人GM-CSF、IL-4基因各自独立和经IRES元件串联的重组真核表达质粒pGM-CSF、plL-4和pGM-CSF-IRES-IL-4，转染细胞并经过连接免疫荧光(indirectimmunofluorescence assay，IFA)及酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，Elisa)检测其表达活性，为构建永久表达细胞系做准备，同时人源细胞因子的体外表达及其诱生DC/CIK培养试剂盒的研发奠定了基础。 方法 1.引物和质粒的设计与合成 依据GenBank上已经公布了的人源性GM-CSF、IL-4基因的参考序列。分别设计了附加酶切位点的引物，酶切位点为XhoⅠ、BglⅡ和SalⅠ、MluⅠ，以及质粒pMD15-T-CSF、 pMD15-T-IL-4。 2.重组质粒pGM-CSF、pIL-4、pGM-CSF-IRES-IL-4的构建 经PCR扩增重组质粒pMD15-T-CSF、pMD15-T-IL-4中的目的片段GM-CSF、IL-4;利用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行回收、琼脂糖凝胶回收纯化好的的PCR产物，分别在各自的酶切位点处进行双酶切，目的是回收两条目的基因片段GM-CSF和IL-4;用T4连接酶分别与经同步酶切的载体片段psT-△SG上进行连接，经在固体培养皿上长出的优势抗性菌落的常规筛选，构建单独表达GM-CSF、IL-4基因的重组质粒pGM-CSF、pIL-4;将目的基因与连接片段IRES分步连接到PsT-△SG载体上，经在固体培养皿上长出的优势抗性菌落的常规筛选，构建pGM-CSF-IRES-IL-4真核表达载体。 3.重组质粒pGM-CSF、pIL-4、 pGM-CSF-IRES-IL-4在CHO细胞中的瞬时表达 将重组质粒pGM-CSF、pIL-4、pGM-CSF-IRES-IL-4在阳性脂质体的介导下转染CHO细胞，24小时后检测GM-CSF、IL-4在CHO细胞中的表达。 4.IFA及Elisa检测表达情况 对转染的CHO细胞用IFA和Elisa检测人源GM-CSF、IL-4基因的蛋白质表达。 结果 1.真核表达质粒pGM-CSF、pIL-4、pGM-CSF-IRES-IL-4的构建 成功构建的三种真核表达质粒pGM-CSF、pIL-4和pGM-CSF-IRES-IL-4，分别在经菌落PCR，质粒的PCR，琼脂糖凝胶电泳双酶切等方法鉴定后构建成功。 2.IFA实验及Elisa实验检测GM-CSF、IL-4表达结果 经过IFA的实验结果显示出，在荧光显微镜的下阳性表达的细胞大约在60％以上左右。Elisa的实验结果显示，GM-CSF、IL-4两种基因在培养的CHO细胞当中能够成功的表达。 结论 1.成功将人源基因GM-CSF、IL-4亚克隆入psT-△SG，分别构建了融合基因真核表达质粒pGM-CSF、pIL-4以及pGM-CSF-IRES-IL-4 2.人源细胞因子GM-CSF、IL-4在真核细胞中表达并鉴定正确，为构建人源细胞因子体外永久性表达细胞系及体外激活DC/CIK奠定了基础。