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目的： 肺癌是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，其发病率和死亡率呈上升趋势。肺癌已成为人类癌症主要死亡原因之一，确诊时多数患者因发展为晚期已失去早期根治性切除的时机。目前大多数化疗药物的毒副作用限制了其临床应用，积极寻找有效的防治药物成为当前的迫切需要。人参皂苷Rh2为人参抗肿瘤效应的主要有效成分。研究表明它对多种肿瘤细胞的生长具有明显的G1期阻滞作用，最终导致细胞发生凋亡。但是人参皂苷Rh2抗肿瘤作用的细胞和分子调控机理目前仍不清楚。为探讨人参皂苷Rh2抗肿瘤作用涉及的信号通路和分子作用网络，以初步阐明人参皂苷Rh2抗肿瘤作用的细胞和分子调控机理，我们研究了人参皂苷Rh2对人肺腺癌A549细胞的作用，并初步探讨了其抑制肿瘤细胞的机制，实验分三部分。 方法： 实验第一部分以人肺腺癌A549细胞为模型，采用MTT实验测定不同浓度人参皂苷Rh2（S型与R型）对人肺腺癌A549细胞增殖抑制作用;碘化丙啶(PI)单染流式细胞仪分析细胞周期中各时期的细胞百分数，观察人参皂苷Rh2对人肺腺癌A549细胞增殖周期的影响。Hoechst33258染色荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学变化。采用免疫荧光实验对作为细胞凋亡标志的caspase-3活性进行测定。通过以上实验研究对能反映人参皂苷结构变化的人参皂苷Rh2（S型与R型）的人肺腺癌A549细胞毒活性进行系统评价，探讨人参皂苷Rh2（S型与R型）对人肺腺癌A549细胞的增殖抑制情况并筛选出有效剂量，以阐述人参活性成分抗肿瘤活性的构效关系及可能机制。 实验第二部分采用透射电镜观察细胞超微结构变化，并应用Western Blotting实验和免疫荧光实验检测caspase-8/9活性及自噬相关分子Beclin-1和LC3的表达情况，以研究自噬在人参皂苷Rh2治疗非小细胞肺癌中的作用和相关性，并探讨人参皂苷Rh2诱导非小细胞肺癌A549细胞株凋亡作用的部分分子机制。 实验第三部分以Western Blotting、免疫荧光和双荧光素酶报告基因等技术检测MAPK信号转导通路相关分子p38、ERK1/2、JNK、AP-1和IκB/NF-κB等的表达，并采用RT-PCR方法对TNF-αmRNA表达水平进行检测，以探讨药物抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的功能与分子机理，研究其抑制肺癌细胞生长或增殖、诱导肺癌A549细胞凋亡作用与相关信号转导通路的关系，为其临床应用提供理论和实验依据。 结果： 1、人参皂苷Rh2对人肺腺癌A549细胞毒活性明显存在构效关系，其中25μg/mL的20(R)-Rh2和20(S)-Rh2作用48h对肿瘤细胞株A549的增殖抑制率分别为28.5％和为33.6％，IC50值分别为33.4μg/mL和28.5μg/mL。 2、碘化丙啶(PI)单染流式细胞仪分析细胞周期中各时期的细胞百分数结果显示，20μg/mL的20(S)-Rh2作用A549细胞24h后G0/G1期细胞比例显著高于对照组(P＜0.01)，S期细胞比例显著低于对照组（P＜0.01），G2/M期细胞比例与对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。说明20(S)-Rh2能阻滞细胞周期于GI期，并且20(S)-Rh2型的抗肿瘤活性明显强于20(R)-Rh2。 3、AnnexinⅤ-PI双染流式细胞术检测定量分析结果表明，30μg/mL的Rh2作用A549细胞24h后，S型和R型人参皂苷Rh2组无论是早期还是晚期凋亡率均明显高于正常组细胞(P＜0.05)，并且20(S)-Rh2组早期凋亡率明显高于20(R)-Rh2组，表现出明显的构效效应;Hoechst33258染色荧光显微镜和透射电镜观察细胞凋亡的形态学变化表明细胞核和细胞的超微结构呈现出典型的早期凋亡形态学特征。并且20(R)-Rh2和20(S)-Rh2作用6h的A549细胞中标记caspase-3活性的荧光亮度明显增强，说明caspase-3的激活参与了Rh2诱导的A549细胞凋亡。 4、Western Blotting实验分析结果显示，20μg/mL人参皂苷Rh2作用A549细胞1-6h，S型和R型人参皂苷Rh2组caspase-8前体的水平均有显著降低（P＜0.05），有活性的剪切的caspase-8水平均有极显著提高(P＜0.01)，并呈时间依赖性;但caspase-9前体和有活性的剪切的caspase-9的水平均无明显改变(P＞0.05)。S型人参皂苷Rh2组Beclin-1的水平在1-4h均有显著提高(P＜0.05);但LC3的各时间点的表达水平未见明显改变(P＞0.05)。R型人参皂苷Rh2组Beclin-1的水平在3-6h均有显著提高(P＜0.05);但LC3的各时间点的表达水平未见明显改变(P＞0.05)。免疫荧光实验结果显示，20μg/mL人参皂苷Rh2作用3h，标记caspase-8活性以及Beclin-1表达水平的荧光亮度明显增强，说明caspase-8活性明显升高，Beclin-1表达水平明显增强。标记LC3表达和caspase-9活性水平的荧光亮度有增强但无显著差异，说明LC3表达和caspase-9活性水平无明显改变。 5、Western Blotting实验分析结果显示，20μg/mL的S型和R型人参皂苷Rh2作用A549细胞1-6h，p38MAPK的磷酸化水平及P38的表达水平都没有明显的改变(P＞0.05);JNK和ERK1/2的表达水平也都没有明显的改变(P＞0.05)，而它们的磷酸化程度则有明显的改变。与A549细胞对照组相比，S型和R型人参皂苷Rh2作用后JNK的磷酸化水平均有显著提高(P＜0.05)，无构型差异;但它们对ERK1/2磷酸化程度影响却呈规律性的处于激活的动态调节中(P＜0.05);免疫荧光实验定性和定位分析实验结果表明，S型和R型人参皂苷Rh2作用A549细胞3-4h，细胞核中标记ERK1/2和JNK磷酸化水平的荧光亮度有明显增加，说明人参皂苷Rh2对ERK1/2和JNK信号通路有激活作用。 6、NF-κB-Luc及AP-1-1uc报告基因相对荧光素酶值在20μg/ml浓度的人参皂苷Rh2作用24h后较正常组细胞均显著提高(P＜0.05)。说明人参皂苷Rh2可诱导转录因子NF-κB和AP-1的转录激活。免疫荧光实验对转录因子NF-κB及AP-1的磷酸化表达水平及核转位做定性定位分析实验结果表明，20μg/mL的S型和R型人参皂苷Rh2作用0.5-1h的A549细胞核中标记NF-κBp65亮度有明显增加;而细胞核中标记c-j un磷酸化水平的荧光亮度在作用0.5-1h的细胞核中未见明显改变，但在作用2-6h的A549细胞核中荧光亮度有明显增加，并表现出时间依赖性。说明人参皂苷Rh2能提高转录因子NF-κB及AP-1的磷酸化表达水平并促进核转位。 7、Western Blotting实验对IκB磷酸化水平进行分析结果显示，20μg/mL浓度的S型和R型人参皂苷Rh2作用1-6h，IκB的表达水平都没有明显的改变(P＞0.05);p-IκB的表达水平在4h-6h均有明显增加(P＜0.05)。说明人参皂苷Rh2诱导A549细胞凋亡作用可能与I-κB/NF-κB信号通路的动态调节有关。 8、RT-PCR实验结果显示20μg/mL浓度的人参皂苷Rh2处理A549细胞24h后，TNF-αmRNA表达水平较A549细胞组显著提高(P＜0.05)。 结论： 1、S型和R型的人参皂苷Rh2均可剂量依赖性地抑制A549细胞增殖，并且20(S)-Rh2型的抗肿瘤活性明显强于20(R)-Rh2，阻滞细胞周期于G1期，具有构效效应。 2、S型和R型人参皂苷Rh2均具有促进A549细胞凋亡作用，并且20(S)-Rh2组早期凋亡率明显高于20(R)-Rh2组，具有构效效应，细胞核和细胞的超微结构呈现出典型的早期凋亡形态学特征，并且caspase-3的激活参与了二者诱导的A549细胞凋亡。 3、人参皂苷Rh2诱导A549细胞凋亡的作用主要是通过调控膜受体通路caspase-8通路实现的，还可能与调控Beclin-1的表达有关，且其作用具有时间依赖性，并且该调节作用与构型无关。 4、人参皂苷Rh2可激活JNK/MAPK通路，激活NF-κB和AP-1转录活性，上调转录因子AP-1的磷酸化水平，激活I-κB/NF-κB信号通路促进NF-κB核转位，并上调转录因子NF-κB和AP-1共同的靶基因凋亡相关细胞因子TNF-α的mRNA表达。 综上所述，人参皂苷Rh2抑制人肺腺癌A549细胞增殖、促进其凋亡功能的分子机理是通过调控JNK/MAPK通路，激活NF-κB和AP-1转录活性，上调转录因子AP-1的磷酸化水平，激活I-κB/NF-κB信号通路促进NF-κB核转位，并上调转录因子NF-κB和AP-1共同的靶基因凋亡相关细胞因子TNF-α的mRNA表达，调节膜受体通路(caspase-8)和/或自噬相关基因Beclin-1表达，从而发挥抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的生物学功能。以上研究将为治疗肺癌新型药物的研制开发提供新思路，为我国传统中医药进一步用于肿瘤的治疗提供实验依据。