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水稻(Oryza sativa L.)是世界上重要的粮食作物,全球一半以上的人口以稻米作为主食。由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病,是对水稻生产为害最严重的病害之一。抗病品种的选育及利用是控制该病害最经济有效的方法。稻瘟病菌小种的多样性及变异常造成品种的抗性衰退甚至丧失,因此,选育持久抗病品种是延缓品种抗性丧失的有效途径。广谱抗性是持久抗性的重要组成部分,深入了解广谱抗性的遗传及抗性特征对选育持久抗病品种有着重要意义。水稻品种28占由于具有对稻瘟病菌的广谱抗性而广泛应用于华南地区水稻育种计划。为了解其广谱抗性的遗传基础以及鉴定其中的广谱抗性基因,本文开展了以下5个方面的研究,结果如下: 1.鉴别菌株的筛选及抗性遗传分析利用9个稻瘟病抗病基因的单基因系,对来自我国不同地区的1170稻瘟病菌株进行了致病性研究,可将测试菌株划为122个致病型。对122个致病型进行了主成分因子分析(PCA),提取出可解释总变量的相关性致病型16类,从上述类型及优势致病类型中,共选取20个稻瘟病菌株作为鉴别菌株,用于抗性遗传分析。 从28占和丽江新团黑谷杂交培育而成的重组自交系(RIL)群体中,随机选出150个株系,用20个鉴别菌株进行人工接种鉴定。对其中12个、6个、2个菌株的抗感株系分离比分别符合1:1,3:1以及7:1,说明28占对上述菌株的抗性分别受1、2、3个基因控制。有趣的是,76个RILs对所测试的菌株同时表现抗性反应,由此推测28占可能含有一个能抵抗不同致病类型的广谱抗性基因。用致病谱较广的2个菌株GD00193和GD98288,对全部297个RIL株系进行了接种,抗感分离比均是1:1分离。进一步证实了28占可能含有一个广谱抗性基因。 2.广谱抗性的基因组成及分析选取对测试菌株均表现全抗或全感的RIL株系各16个,分别构建抗、感基因池。从520个SSR标记中,筛选获得350个对抗、感亲本EBZ和LTH有多态的标记,用这些标记对抗、感基因池进行筛选。经过第一轮筛选,有少数标记在感池和感病亲本之间有一致的带型,但未发现在抗池和抗性亲本中表现一致带型的标记,后者可能是抗性基因之间相互掩盖所造成的。为此,作者仅用感病个体来进一步验证标记与候选基因的连锁关系。结果表明,在第1染色体的RM302和RM11762、第6染色体的RM136和AP22、第12染色体的RM27933和RM7102与28占的候选抗性基因具有连锁关系。而标记界定的区域分别与已知抗病基因Pish,Pi2/Pi9以及Pita/Pita-2座位所在的区域重叠。 为了明确28占所持的抗性基因与已知抗性基因的相互关系,作者筛选出仅含一个候选基因的6个RIL株系,并用523个稻瘟病菌株对这些株系以及携带不同已知抗性基因的单基因系或基因型品种进行了抗谱比较分析。结果表明,含有来源于28占Pish座位的E22和E60,以及含有来源于28占Pita-2座位的E58和E121分别与Pish单基因系IRBLsh-S,以及Pita-2单基因系IRBLta2-Re表现出极为相似的抗感反应。而含有Pi2/Pi9区域座位的E47和E85与其它基因的反应类型相差很大,其抗谱更广。综合上述结果,在28占所含的3个稻瘟病抗病基因中,其中2个是Pish和Pita-2,另一个基因可能是Pi2/Pi9抗性基因家族的新成员,暂命名为Pi50(t)。 3.广谱抗性基因Pi50(t)的精细定位为了进一步定位P150(t),作者利用在基因池分析中获得的连锁标记RM136和AP22对RIL群体进行了分析,并结合GD98288和GD00193接种的抗感数据,将目标基因初步定位在RM136和AP22之间,与上述标记的遗传距离分别是6.6 cM和2.7cM。 在RM136和AP22基因组区域设计了50个分子标记,其中13个表现出多态性。首先利用RM136和AP22对652个来源于F2和BCIF2的感病个体进行了分析,检出了87个重组体,其中RM136检出的60个有别于APP22检出的27个。然后,利用13个多态性标记对这些重组体进行了分析,标记GDAP26、GDAP39、GDAP41、GDAP33、GDAP32、GDAP17以及GDAP51检出的重组体个数分别是36、21、17、13、5、2、1,这些个体均包含在RM136检出的重组体中;而标记GDAP23,GDAP37,GDAP16分别检出9、5、1个重组体,与AP22检出的重组体重叠;GDCP1、GDG4-3以及GDAP47等3个标记则没有检出重组体,与目标基因共分离。依据日本晴基因组参考序列,目标基因最终被界定于GDAP51和GDAP16之间、PAC克隆P0649Cll(AP005659)上约53 kb区域。 4.Pi50(t)的抗性及结构域特征利用523个稻瘟病菌株,对2个含有Pi50(t)基因的近等基因系,以及含有Pi2/Pi9座位上其它抗病基因的单基因系或基因型品种进行抗性分析。Pi50(t)在抗性反应类型以及抗谱方面均与其它等位基因存在明显的差异;Pi50(t)的近等基因系表现出较广的抗谱,其抗谱达97.7%,Pi9、Pi2、Piz以及Piz-t等单基因系或基因型品种的抗谱分别是93.7、92.2、68.4以及54.5%。 在Pi2/Pi9座位上选择了4个NBS-LRR旁系基因进行了8个等位基因的LRR结构域比较分析。这8个等位基因所持品种分别是:28占(Pi50(t))、75-1-27(Pi9)、C101A51(Pi2)、IRBLzt-T(Piz-t)、IRBLz-Fu(Piz)、Gumei4(Pigm(t))、Gumei2(P/26(t))以及IR65482-4-13(P/40(t)_。对8个等位基因的LRR结构域进行了扩增、序列分析,NBS-LRR1和NBS-LRR7的LRR序列在8个等位基因间表现很保守,序列十分相似,而NBS-LRR2和NBS-LRR4的LRR结构域在不同的等位基因之间差异显著。对于NBS-LRR2直系基因,Pi50(t)与Pi2,Pi9,Piz,Piz-t,Pi26(t),Pigm(t)以及Pi40(t)在LRR区域的氨基酸差异分别是21、19、18、23、3、3、20个;而对于NBS-LRR4直系基因,它们之间氨基酸的差异分别是13,19,19,38,41,41及20个。 5.利用“28占”改良优质稻品种马坝银占的稻瘟病抗性为了明确来源于28占的3个稻瘟病抗病基因是否能有效地应用于马坝银占的抗性改良,作者对来自该品种产地的10个稻瘟病菌株进行了致病性分析。结果表明,分别含源于28占3个抗性基因的重组自交系均对10个测试菌株表现出抗性,说明可以用于其抗性改良。利用分子标记及加代回交法,构建了分别含有Pish、Pita-2和Pi50(t)的6个BC3F5高世代品系。用人工接种及病区鉴定方法,对新选育的新品系进行了抗性评价。结果表明,含有Pi50(t)基因的品系ME-50-1和ME-50-2对所有接种菌株表现抗性,并在不同的病区表现出优异的田间抗性。而含其它2个基因的4个品系ME-sh-1和ME-sh-2(含Pish),ME-ta2-1和ME-ta2-2(含Pita-2)表现出中等的抗性,其抗谱为80.0~86.7%,在马坝银占产地广东省曲江樟市病区表现出良好的田间抗性,但在非产地吕田病圃表现感病。对其中3个携带有不同抗性基因的品系ME-sh-1、ME-ta2-1以及ME-50-1进行了13个农艺性状指标的评价。结果表明,新选育的品系在性状上与受体品种马坝银占十分接近或差异微小、在一些性状上略好于受体品种。根据上述试验结果,新选育的品系可以应用于马坝银占产地,并可作为多系品种,通过品种轮换,进行稻瘟病的持续控制。