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猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的使不同年龄的猪发生急性、高度接触性的一种传染病。其中,神经系统障碍和脏器损伤为其主要的病理特征。该病是危害养猪业健康发展的重大疾病之一,给养猪业造成了巨大的经济损失。先前有研究表明PRV感染会扰乱细胞线粒体功能,而线粒体功能的破坏与神经系统的病变密切相关。PRV已被报道可引起培养的猪神经元凋亡。此外,病毒感染常引起机体广泛的氧化应激反应,从而加快疾病的发生与发展。而众所周知,氧化应激和凋亡都与细胞线粒体功能紊乱密切相关,因此,上述研究信息提示神经元氧化应激、线粒体功能紊乱和凋亡是PRV感染引起神经系统病变的关键因素,这为使用抗病毒药物控制PRV感染提供了潜在的作用靶标。姜黄素（Curcumin,CUR）是姜黄发挥药理作用的活性成分之一。具有抗氧化、抗炎、抗癌等生物活性。而近年来,CUR作为抗病毒药物的潜力备受关注。研究发现,CUR具有抗多种病毒的活性,如单纯疱疹病毒和人类免疫缺陷病毒等。然而是否CUR能抵抗PRV感染对神经元的损伤尚未见相关报道。由于CUR具有穿越血脑屏障的能力,因而对于神经系统疾病的防治具有广阔的应用前景。因此,我们假设CUR可以减轻PRV感染引起的神经元损伤,而神经元中与线粒体功能紊乱密切相关的氧化应激和细胞凋亡途径可能参与了该过程。脑源性神经营养因子（Brain derived neurotrophic factor,BDNF）是神经营养蛋白家族的成员,在哺乳动物脑中神经营养蛋白表达最广泛。以前的研究表明,BDNF可通过与定位于线粒体膜的跨膜酪氨酸激酶B（Tyrosine kinase B,Trk B）受体结合,发挥抗氧化损伤和抗凋亡的作用。增加的BDNF可以抵抗3-硝基丙酸诱导的原代大鼠皮层培养物中的线粒体功能障碍。但是,尚未有研究证明PRV感染是否会影响海马神经元中BDNF的表达,如果答案是肯定的,那么我们推测BDNF/Trk B途径可能介导了CUR在PRV感染期间的神经保护作用。为了验证上述的假设和推测,探究CUR对PRV感染的神经保护效果及其潜在机制。本研究开展了以下试验。体外试验:取初生24h内大鼠海马进行海马神经元的原代培养,经纯度检测与鉴定后,用PRV感染神经元确定最佳感染时间建立氧化应激模型。之后添加不同浓度CUR探索其抵抗病毒感染保护神经元的最佳浓度,并进一步探讨BDNF启动的抗氧化、抗线粒体紊乱及凋亡途径是否介导了PRV感染期间CUR的神经保护作用,且通过加入BDNF受体Trk B的特异性抑制剂ANA-12阻断BDNF/Trk B信号途径进行验证。其研究结果如下:1.体外原代培养的海马神经元经鉴定,纯度达到95%以上。与对照组相比,病毒滴度为3.06×10~6TCID50的PRV在感染海马神经元2,4,6和8 h后,MDA含量呈时间依赖性的增加,而在2 h时已显著增加（P<0.05）;而SOD酶活性呈时间依赖性的降低,并且在2 h时达到极显著降低（P<0.01）;同时NO的含量也在2 h时极显著增高（P<0.01）,这些结果表明PRV感染2h引起了海马神经元的氧化损伤。2.使用不同浓度CUR处理海马神经元24 h,结果表明,浓度在20μmol/L以上的姜黄素会影响神经元的活性;然后使用浓度为20μmol/L以下的姜黄素预处理24h后,添加PRV感染神经元2 h,发现2.5-10μM姜黄素能保护海马神经元免遭感染损伤,且当姜黄素浓度为10μmol/L时,神经元的活性最高（P<0.01）,因此确定姜黄素抵抗PRV感染保护神经元的最佳浓度为10μmol/L。3.通过Western-Blot检测海马神经元中BDNF的蛋白水平变化发现,与对照组相比,PRV感染组BDNF蛋白表达水平显著下降（P<0.05）;与PRV感染组相比,姜黄素治疗组的BDNF蛋白水平显著升高（P<0.05）。结果表明BDNF介导了姜黄素抗PRV感染保护海马神经元的过程。4.为了进一步验证BDNF/Trk B是否介导了姜黄素抗PRV感染保护海马神经元的作用过程,本研究通过对乳酸脱氢酶（LDH）活性的检测考察添加Trk B抑制剂ANA-12对神经元活力的影响。结果发现,与对照组相比,PRV感染组的LDH水平极显著增高（P<0.01）;与PRV感染组相比,姜黄素治疗组的LDH水平极显著降低（P<0.01）;而与姜黄素治疗组相比,抑制剂组的LDH水平极显著增高（P<0.01）,并且单独加入抑制剂不影响神经元活性,表明姜黄素通过调节BDNF/Trk B途径保护海马神经元免受PRV感染损伤。5.为了考察BDNF/Trk B途径调节的氧化应激及凋亡分子途径是否介导了姜黄素的抗PRV感染保护神经元作用效果,Western-Blot检测了Trk B、n NOS及凋亡/抗凋亡相关分子的蛋白质水平或活性。检测结果显示,与对照组相比,PRV感染组的n NOS（P<0.01）、Bax（P<0.05）蛋白质水平显著增高,而Bcl-2（P<0.01）、Trk B（P<0.05）蛋白质水平显著降低,同时Caspase-3活性极显著增高（P<0.01）;与PRV感染组相比,姜黄素治疗组n NOS（P<0.05）、Bax（P<0.01）蛋白质水平显著降低,而Bcl-2、Trk B蛋白质水平显著升高（P<0.01）,同时Caspase-3活性极显著降低（P<0.01）;而与姜黄素治疗组相比,抑制剂组n NOS、Bax蛋白质水平显著增高（P<0.01）,而Bcl-2、Trk B蛋白质水平显著降低（P<0.01）,而Caspase-3活性显著升高（P<0.05）,以上这些结果显示,姜黄素减少了PRV诱导的n NOS和凋亡相关蛋白水平或活性的上调,并增加了PRV诱导的抗凋亡相关蛋白的下调,而阻断BDNF/Trk B途径消除了这种作用。6.为了考察BDNF/Trk B途径调节的线粒体功能是否介导了姜黄素抵抗PRV感染保护神经元作用效果,本试验检测了线粒体膜电位（Δψm）和ATP的水平,结果发现,与对照组相比,PRV感染组ATP和Δψm水平均极显著下降（P<0.01）;与PRV感染组相比,姜黄素治疗组ATP和Δψm水平都显著升高（P<0.01）;而与姜黄素治疗组相比,抑制剂组ATP和Δψm水平都显著下降（P<0.01）。但Trk B抑制剂的添加,阻止了姜黄素的保护作用,由此表明,BDNF/Trk B途径介导了姜黄素抵抗PRV感染引发的神经元线粒体功能紊乱,从而发挥神经元保护作用。为进一步证实姜黄素的抵抗PRV感染保护神经的作用效果,随之我们开展体内试验。体内实验:取60只180-220g SD大鼠,随机分成6组,即对照组、PRV感染组、PRV+CUR低（25mg/kg）、PRV+CUR中（50mg/kg）、PRV+CUR高（100mg/kg）剂量组以及白藜芦醇组（阳性对照组）。其中姜黄素抗感染组和阳性对照组连续腹腔注射相应剂量药物14天,而对照组和PRV感染组注射相同剂量0.5%的羧甲基纤维素钠溶液。第8天除对照组外,其余各组注射滴度为2.85×10~3TCID50的PRV 100μL,待感染PRV的第7天,麻醉剖杀各组大鼠,检测相应指标。试验结果如下:1.截至攻毒第7天时,对照组大鼠的存活率为100%,PRV组存活率为70%,PRV+姜黄素低剂量组存活率为70%,PRV+姜黄素中剂量组存活率为100%,PRV+姜黄素高剂量组存活率为90%,阳性对照组存活率为90%,结果表明,姜黄素中剂量,即在50mg/kg时,抗病毒效果最好,因此选用姜黄素中剂量组进行后续实验。2.检测氧化/抗氧化指标发现,与对照组相比,PRV组脑组织、肝脏和肺脏中MDA含量显著升高（P<0.05）,GSH含量和SOD活性显著降低（P<0.05）,表明PRV感染引起了机体组织的氧化损伤;而与PRV组相比,姜黄素中剂量组脑组织、肝脏和肺脏中MDA含量显著降低（P<0.05）,GSH含量和SOD活性显著升高（P<0.05）,表明CUR可以缓解由PRV感染引起的大鼠氧化应激。3.病理切片结果表明,与对照组相比,PRV组的海马组织有不同程度的病变,而与PRV组相比,姜黄素使这些病变明显改善。综上所述,本研究证明CUR能抵抗PRV诱导的大鼠海马神经元氧化应激、凋亡和线粒体功能障碍,从而发挥保护神经元的作用,而上调的BDNF/Trk B通路介导了这个过程。此外,通过体内试验进一步证实了姜黄素能减少PRV感染引起的大鼠组织尤其是海马组织的损伤,为姜黄素作为抗伪狂犬病毒药物及神经紊乱保护剂的研发奠定了基础。