论文部分内容阅读
TOR（Target of Rapamycin）是一种存在于真核生物中进化保守的Ser/Thr激酶，属于磷脂酰肌醇-3激酶相关蛋白激酶（PIKK）家族。雷帕霉素是一种大环内酯类免疫抑制剂，通过与FKBP12结合抑制TOR活性。在多种真核生物中，TOR是细胞生长、新陈代谢、营养、能量、激素、胁迫响应等重要的调节因子。TOR蛋白具有高度保守的结构，从N端到C端依次为HEAT重复、FAT域、FRB域、激酶域、FATC域。在酵母和动物中，TOR构成TOR complex1（TORC1）和TOR complex2（TORC2）两种不同的复合物。TORC1能被雷帕霉素抑制，调节翻译、核糖体合成、细胞生长等响应营养和能量变化。TORC2不被雷帕霉素抑制，调节细胞骨架、细胞周期、细胞凋亡等。目前对植物TOR的研究主要集中在拟南芥，相比其他真核生物，对植物TOR的了解有限。WT拟南芥对雷帕霉素不敏感，但过表达ScFKBP12的拟南芥转基因株系BP12对雷帕霉素敏感，在雷帕霉素处理下其生长受到抑制。本研究从二穗短柄草克隆了TOR基因，并对其结构和功能进行了初步分析，获得以下结果：1.常规剂量（1μM）的雷帕霉素对短柄草的萌发和生长没有影响，但是高浓度（100μM）的雷帕霉素对短柄草的萌发和生长具有显著抑制作用。2.从二穗短柄草中克隆得到长7401bp的TOR基因，命名为BdTOR。BdTOR编码一个含2466个氨基酸残基的蛋白质，预测其结构域包含HEAT重复域（1-1296）、FAT域（1297-1877）、FRB域（1755-2110）、激酶域（2077-2466）、FATC域（2434-2466）。3.实时定量PCR分析表明BdTOR在短柄草各器官中表达量不同，由高到低依次为青种、幼苗、根、叶、茎。4.瞬时表达实验表明BdTOR激酶域（2077-2466）定位于拟南芥原生质体的细胞核和细胞质，并且在细胞质中呈区域化分布。5.构建植物表达载体pOEBdTOR、pOEBdTORF1、pOEBdTORF2、pOEBdTORF3转化WT和BP12，以过表达BdTOR（1-2466）、BdTORF1（1-1259）、BdTORF2（1251-2466）、BdTORF3（1745-2466）等片段进行功能研究。6.过表达BdTOR或其部分片段可以回补或部分回补雷帕霉素对拟南芥株系BP12的抑制作用，但未改变其雷帕霉素敏感的特性，表明在雷帕霉素处理下BdTOR的FRB域与ScFKBP12可能存在相互作用。7.在BP12或WT中过表达BdTOR能够提高拟南芥的生长速率，表现为相同生长时间内叶片更大、主根更长、根系更发达，从而使转基因拟南芥具有更大的生物量。8.过表达BdTOR也加强了蔗糖对拟南芥生长的促进作用，这表明TOR功能与植物生长、糖代谢均密切相关。综上所述，本研究率先从二穗短柄草中克隆了BdTOR基因，并初步分析了其结构和功能，为深入研究其生物学功能提供了基础，也为分子育种提供了新的备选基因。