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leachii支原体可直接引起犊牛多发性关节炎和母牛乳房炎,与犊牛肺炎有关,属于支原体科(Mycoplasmataceae)、支原体属(Mycoplasma)、丝状支原体族(Mycoplasma mycoides)成员之一。其引起的犊牛多发性关节炎的致死率不高,但是对关节造成的不可逆性损伤,导致发病犊牛100%淘汰,对养牛业具有较大威胁。我国于2009年在患关节炎犊牛的关节液内分离获得leachii支原体。目前,国内外对leachii支原体的研究主要集中于病原的分离鉴定、遗传进化分类以及致病性等方面,而对该病原的致病机理、传播途径以及防控措施的研究还鲜有报道。已有研究表明,支原体对宿主细胞的直接粘附是其感染的第一步,是研究支原体致病机制的重要方面,因此对leachii支原体粘附蛋白的筛选及鉴定有助于阐明其致病机制。本研究采用序列分析、同源性比对、蛋白表达及细胞粘附与粘附抑制试验等方法,筛选并鉴定leachii支原体的粘附蛋白。通过对leachii支原体全基因组序列的分析,并与其他支原体已鉴定的粘附蛋白进行同源性比对,假定lppA基因和eno基因编码的LPPA蛋白和a-烯醇酶为leachii支原体的粘附相关蛋白。用原核系统表达LPPA蛋白及a-烯醇酶,通过Ni-NTA纯化后免疫小鼠制备抗LPPA及a-烯醇酶的多克隆抗体。Western blot分析表明,LPPA蛋白为leachii支原体的外膜脂蛋白,a-烯醇酶分泌表达于leachii支原体的细胞膜上。通过粘附及粘附抑制试验对重组蛋白的粘附特性进行鉴定,利用激光共聚焦显微镜可观察到抗LPPA及a-烯醇酶的多克隆抗体均能够特异性抑制leachii支原体对胎牛关节滑膜细胞的粘附作用；同时对激光共聚焦图片采用Columbas图像分析软件计算粘附抑制率,结果显示,1：25倍稀释的抗LPPA和a-烯醇酶的多克隆抗体对leachii支原体的粘附抑制率分别为58.3%和55.82%,而同比稀释的leachii支原体全菌体多克隆抗体的粘附抑制率为79.26%。ELISA试验结果表明,重组LPPA蛋白可与关节滑膜细胞膜蛋白发生特异性粘附作用,并且这种粘附作用可被相应的多克隆抗体特异性抑制,而a-烯醇酶不能够与胎牛关节滑膜细胞膜蛋白在体外发生特异性粘附作用。上述结果表明,LPPA蛋白和a-烯醇酶为leachii支原体的粘附相关蛋白,这为leachii支原体致病机理的研究提供了实验依据。单克隆抗体由可以分泌抗体的单一脾细胞与骨髓瘤细胞融合后产生,这种融合后的细胞同时具有肿瘤细胞不断增殖和免疫细胞分泌抗体的能力,可以产生大量相同的抗体；具有高度特异性、均质性及来源稳定等优点,被广泛应用于诊断、治疗以及实验研究等领域。已有研究表明,单克隆抗体在支原体诊断及粘附蛋白筛选鉴定方面发挥了重要作用。本研究以leachii支原体全菌体蛋白作为免疫原,采取皮下多点注射、肌肉注射、腹腔注射和脾内注射相结合的免疫策略免疫BALB/c小鼠；SP2/0骨髓瘤细胞与脾细胞融合后,采用间接ELISA及Western blot方法筛选阳性克隆；经三次有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆,共获得10株leachii支原体单克隆抗体,腹水效价为1：103～1：106,亚型为IgM和IgG1,轻链均为K型。Western blot分析显示,所有单克隆抗体均与leachii支原体发生特异性反应。粘附抑制试验结果显示,其中2株单克隆抗体能够特异性抑制leachii支原体对胎牛关节滑膜细胞的粘附作用,这为进一步筛选leachii支原体粘附蛋白建立了实验基础。