口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virues,FMDV）引起的偶蹄动物的一种烈性传染病,其严重损害畜牧业的生产,每年都造成巨大的经济损失。FMDV属于微RNA病毒科（Picornaviridae）口蹄疫病毒属（Aphthovirus）的成员。与微RNA病毒科其他病毒成员一样,FMDV基因组缺乏5’端帽子结构,其蛋白翻译的起始依赖于5’非编码区的内部核糖体进入位点（Internal ribosome entry site,IRES）。越来越多的研究证实,IRES介导翻译的调控是病毒感染的关键步骤,对病毒的毒力、致病性以及组织嗜性具有重要的影响。因此,深入研究病毒IRES元件介导的翻译调控机制,对阐明FMDV的致病机理具有重要意义。在本实验室的前期研究中,通过RNA pulldown方法结合质谱分析筛选获得8个与FMDV IRES相互作用的宿主细胞蛋白。本研究选取其中的hnRNP K蛋白进行深入的研究。hnRNP K属于hnRNP蛋白家族的成员,是一种多功能蛋白,通过与核酸和蛋白相互作用参与细胞的调控转录、翻译、可变剪接、mRNA稳定性、染色质重塑、信号转导等生物学过程。为了研究hnRNP K与病毒IRES的相互作用,本研究首先利用RNA pulldown试验检验BHK-21细胞样品,经hnRNP K特异性抗体检测证实,hnRNP K与FMDV IRES发生相互作用;进一步的研究证实,FMDV IRES与FMDV不同种属易感动物细胞的hnRNP K均存在相互作用;通过竞争结合试验证实,hnRNP K与FMDV IRES相互作用是特异性的;利用原核表达的hnRNP K蛋白进行RNA pulldown试验表明,hnRNP K与FMDV IRES呈现直接的相互作用;RIP试验表明,在FMDV感染细胞中hnRNP K与FMDV基因组RNA也呈现相互作用,而激光共聚焦显示hnRNP K与FMDV基因组RNA共定位于细胞质,进一步证实在FMDV感染细胞中hnRNP K与FMDV基因组RNA的直接相互作用。上述结果表明,hnRNP K与FMDV IRES在体内和体外均发生特异性相互作用。进一步的研究发现,hnRNP K通过其KH2和KH3结构域与FMDV IRES的Domain II、III和IV发生相互作用。在BHK-21细胞中,hnRNP K的过表达可抑制FMDV蛋白VP2的表达、降低病毒的复制滴度以及抑制病毒基因组的复制水平;相反,特异性沉默内源性hnRNP K的表达可以促进病毒蛋白VP2的表达、提升病毒的复制滴度以及提高病毒基因组的复制水平。这些结果表明,在FMDV感染细胞的早中期hnRNP K对FMDV复制具有明显的抑制作用。但我们也发现,在病毒感染细胞的晚期,hnRNP K失去对病毒复制的抑制作用。另外,hnRNP K的过表达可抑制EMCV蛋白VP1的表达、降低病毒的复制滴度以及抑制病毒基因组的复制。这个结果提示,hnRNP K对携带II型IRES的病毒可能均具有广谱的抑制作用。进而,本研究揭示了hnRNP K抑制FMDV复制的分子机制。结果发现,hnRNP K通过与PTB蛋白竞争结合病毒IRES,负调控IRES介导的翻译活性,从而抑制FMDV的复制。然而,在FMDV感染过程中,病毒的3Cpro蛋白酶以依赖自身蛋白酶活性的方式在Q364位点上切割hnRNP K,从而拮抗hnRNP K对病毒的抑制作用。有趣的是,hnRNP K被病毒3Cpro蛋白酶切割产生的两种产物对FMDV的复制发挥截然相反的功能,其中N-端切割产物hnRNP K1-364保留部分抑制IRES介导翻译以及病毒复制的活性,而C-端切割产物hnRNP K364-465变成病毒复制的正调节因子。综上所述,本研究发现hnRNP K是微RNA病毒一个新的IRES反式作用因子（IRES-transacting factor,ITAF）,其通过抑制病毒IRES介导的翻译负调控FMDV的复制。进一步的研究证实,hnRNP K通过干扰PTB与FMDV IRES的结合去抑制IRES介导的翻译。同时发现,病毒在感染过程中通过自身蛋白酶3Cpro切割hnRNP K拮抗其对FMDV的抑制功能。本研究揭示了细胞hnRNP K蛋白调节病毒IRES介导的翻译以及FMDV利用蛋白酶修饰hnRNP K的分子机制,为微RNA病毒感染过程中的翻译控制提供新的见解。