“肿瘤干细胞”理论的提出,为恶性肿瘤的复发和转移提供了新的理论基础,也为肿瘤治疗指出了新的方向和策略。肿瘤干细胞理论认为:恶性肿瘤组织中存在一小群自我更新能力很强的细胞,它们既具有肿瘤细胞的特性,又具有干细胞的特性,所以被称为肿瘤干细胞（Cancer Stem Cells,CSCs）。目前的观点认为,肿瘤干细胞对化疗药物具有很强的耐药性,是恶性肿瘤复发和转移的真正根源,所以靶向治疗肿瘤干细胞已经成为抗肿瘤治疗的重点研究方向。c-MYC蛋白（MYC Proto-Oncogene Protein,c-MYC）是各种类型癌症中扩增程度最高的癌基因之一,所有类型癌症中约有75%均呈现过度表达,c-MYC在恶性肿瘤的发生发展和肿瘤干细胞性能维持中都具有重要作用,也是治疗肿瘤干细胞的重要靶点。但与RAS等著名的癌基因相似,它被认为是一种“难以用药物治疗”的蛋白质,因为其蛋白结构缺乏药物结合的合适位点,至今临床上仍缺乏有效的c-MYC靶向药物,以c-MYC为治疗靶点已经成为抗癌研究领域的关键挑战之一。我国是肝癌大国,肝癌患者基数庞大且增长迅速,晚期肝癌往往难以手术治疗,而晚期肝癌一线用药索拉菲尼的远期治疗效果也不理想,患者迫切需要更加有效的治疗药物。针对晚期肝癌患者治疗的重大需求、肿瘤干细胞的特殊性能、以及上述相关癌基因的特性分析,我们的研究目的就是寻找能够有效抑制肝癌肿瘤干细胞性能的小分子候选药物,并研究其发挥作用的分子机制和治疗靶点,从而抑制晚期肝癌的复发和转移,为晚期肝癌的靶向治疗提供新的途径。在抗肿瘤干细胞的药物研究中,硒化合物具有出色的治疗作用,已有文献报道硒化合物能改变肿瘤干细胞的氧化还原代谢,还有的硒化合物能靶向Wnt/β-catenin信号通路降低肿瘤干细胞的干性。在本研究中,我们通过筛选比对,发现了一种新的有机硒化合物CU27,通过抑制c-MYC的转录功能,有效的降低肝癌肿瘤干细胞的干性,显著抑制肝癌细胞在体内的成瘤能力和转移能力,并揭示了c-MYC-hn RNPU通路对肝癌肿瘤干细胞性能的重要作用,从而为靶向肝癌肿瘤干细胞提供了新的治疗靶点。本研究主要包括四部分内容:一、具有抑制肝癌肿瘤干细胞性能的小分子化合物的筛选我们首先从小分子化合物库中初选了16种候选分子,并对其进行了三维培养体系的功能验证,以肝癌肿瘤干细胞标志物CD13、CD133的表达和肿瘤细胞成球（Tumor-Sphere forming）能力作为筛选标准,用来评价小分子对肝癌肿瘤干细胞的作用。其中小分子CU27效果最为显著,且正常肝细胞毒性较小,具有良好的抑制肝癌肿瘤干细胞性质和功能的潜力,因而成为我们进一步研究的候选靶分子。二、CU27抑制肝癌肿瘤干细胞性能的体内外实验验证通过筛选我们获得较为理想的候选分子CU27,为进一步明确CU27对肝癌肿瘤干细胞的作用,我们根据肿瘤干细胞的特有的生物学性能,设计了体外实验和体内试验来检验CU27的治疗作用。体外实验中我们考察了CU27对肝癌细胞成球能力、耐药能力、侵袭能力和干性标志物表达等的影响,实验结果显示CU27能使Huh7.5.1、PLC/PRF/5和Hep3B等肝癌细胞的成球能力分别降低68.8%、78.5%和86.1%;对其耐药能力、侵袭能力以及多种肝癌肿瘤干性标志物的表达也有显著抑制作用,而且也能有效抑制富集的肝癌肿瘤干细胞的干性相关功能,说明CU27在体外能有效抑制肝癌肿瘤干细胞性能。体内试验中我们考察了CU27对肝癌细胞体内成瘤能力、侵袭转移能力和耐药能力的影响,结果显示CU27能显著抑制肝癌细胞在小鼠体内的成瘤能力,分别使106、105和104组荷瘤小鼠的成瘤率降低28.6%、87.5%和66.7%;还能抑制体内肝癌细胞的转移能力,与对照组相比CU27治疗组小鼠肺转移结节总数降低67.9%,转移灶总体积降低43.6%;与阿霉素（Doxorubicin,DOX）联用能明显的改善荷瘤小鼠的生存率和生存状态,且CU27与索拉菲尼联用能显著增强对索拉菲尼耐药型肝癌的治疗效果。综上所述,CU27在体内外实验中都能显著降低肝癌肿瘤干细胞的性能,具有很好的治疗潜力和应用价值。三、CU27结合c-MYC蛋白并抑制其对靶基因启动子的转录激活为了进一步研究CU27发挥作用的分子机制,我们检测了CU27作用肝癌细胞后的基因表达谱芯片,并筛选出在两种肝癌细胞系中共同表达的差异基因,将这些共同差异基因进行生物信息学分析并利用独创性生物通路分析（Ingenuity Pathway Analysis,IPA）预测上游调控点,结果提示c-MYC很有可能是CU27的关键生物靶分子,CU27通过抑制c-MYC蛋白的转录功能,降低下游靶基因的表达,特别是以RNA剪切调控因子的相关基因下调最为明显。为了明确CU27与c-MYC之间的相互作用,我们设计了双荧光素酶报告实验、染色质免疫共沉淀实验（Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP）、免疫共沉淀实验（Co-Immunoprecipitation,Co IP）和表面等离子共振实验（Surface Plasmon Resonance,SPR）来探究CU27对c-MYC的作用,实验结果显示CU27能直接结合c-MYC蛋白的b HLH结构域,阻碍其与DNA启动子的有效结合,使c-MYC无法激活下游靶基因的转录,降低了c-MYC靶基因的表达。同时,我们在肝癌细胞中过表达c-MYC能显著削弱CU27的治疗作用,也说明了c-MYC是CU27发挥作用的关键生物靶分子。四、CU27通过抑制c-MYC-hn RNPU通路降低肝癌肿瘤干细胞的性能在前面实验基础上,我们进一步探究了下调的c-MYC靶基因中哪些是CU27发挥作用的关键基因,通过IPA分析和实验验证,结果提示hn RNPU很可能是CU27的关键靶基因。为了验证c-Myc-hn RNPU通路在肝癌细胞中的生物学作用,我们敲低和过表达肝癌细胞中hn RNPU的表达以及其他实验,结果显示c-Myc-hn RNPU通路对肝癌细胞干性性能有协同促进作用,包括增殖、自我更新能力和克隆形成能力等。改变其中任何一个的表达都会影响另一个,两者随着肝癌病程的进展不断上调彼此的表达强度。此外肝癌组织芯片结果显示hn RNPU和c-Myc具有共定位和正相关性,其二者的表达强度与肝癌患者病理分级和不良预后具有相关性,说明hn RNPU在c-Myc介导的肝癌中的具有重要的临床意义。本研究中我们阐述了CU27通过抑制c-MYC转录功能降低hn RNPU的表达,有效的阻断c-MYC-hn RNPU调控环路,进而抑制肝癌肿瘤干细胞的干性和功能,降低肝癌细胞自我更新能力和转移能力。首次揭示了c-MYC-hn RNPU通路在维持和促进肝癌肿瘤干细胞性能中的重要作用,为靶向肝癌肿瘤干细胞的治疗提供了新的途径和策略。