黄曲霉毒素B1（AFB1）是由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物,广泛存在于发霉的食品和饲料中,具有强的致癌性、肝毒性和免疫毒性,给人类和动物的生命健康造成极大的威胁。此外AFB1诱导的免疫毒性被认为是动物疫苗免疫失败的一个重要原因,因此对AFB1的免疫毒性研究具有重要意义。DNA甲基转移酶是催化DNA甲基化的重要酶类,在机体内细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程中发挥着重要的作用,其异常表达也被发现在众多疾病的发生发展过程,如肿瘤、免疫性疾病等。目前关于AFB1与DNA甲基化之间关系的研究主要集中于AFB1致癌性研究,而AFB1的免疫毒性与DNA甲基化关系的研究尚未进行。JAK2/STAT3信号通路可以直接介导胞外细胞因子和胞内基因表达,在机体的免疫调节中发挥着重要作用,是研究免疫疾病的重要信号通路。但是AFB1诱导的免疫毒性是否与JAK2/STAT3信号通路有关尚未研究。已有研究证明DNA甲基转移酶可以通过促进JAK2/STAT3信号通路活性参与炎性疾病发生过程。本试验以猪肺泡巨噬细胞作为体外细胞模型,探讨AFB1诱导的免疫毒性是否与DNA甲基化有关?研究DNA甲基转移酶是否通过影响JAK2/STAT3信号通路参与AFB1诱导的免疫毒性?试验一黄曲霉毒素B1对猪肺泡巨噬细胞的免疫毒性作用研究为探讨AFB1对猪肺泡巨噬细胞的免疫毒性,本试验以猪肺泡巨噬细胞作为体外研究模型。在试验过程中,应用MTT法和LDH检测法检测细胞活性,应用RT-PCR法检测促炎细胞因子以及凋亡相关蛋白表达,应用中性红试验检测吞噬功能,应用流式细胞仪检测凋亡细胞数,应用DAPI染色观察凋亡小体,应用Western blot和间接免疫荧光方法测定γH2AX表达,并应用试剂盒检测细胞内活性氧含量和GSH释放量。结果表明:随着AFB1浓度增加,AFBI诱导的免疫毒性逐渐增强,且AFB1浓度达到0.04μg/mL时,能够显著性降低细胞活性和吞噬功能,诱导细胞凋亡和氧化应激,同时造成DNA损伤。试验二DNA甲基转移酶在AFB1诱导的免疫毒性中的作用研究首先在不同浓度AFB1暴露情况下,检测表观遗传相关酶的mRNA表达水平。结果显示:随AFB1浓度升高,表观遗传相关酶的HAT、DNMT1、DNMT3a和HDAC mRNA表达水平升高,而DNMT3b的表达水平不改变,同时Western blot检测DNMT1和DNMT3a的蛋白表达与RT-PCR试验的结果相似,猜测DNA甲基转移酶在AFB1诱导的免疫毒性中发挥着重要作用,所以在后续试验主要研究DNA甲基转移酶在AFB1诱导的免疫毒性的机制。为了进一步研究DNA甲基转移酶在AFB1诱导的免疫毒性中作用,选择DNA甲基转移酶抑制剂（5-Aza-2dc）来抑制DNMT1和DNMT3a表达,同时检测细胞的细胞活性、细胞凋亡、吞噬功能、促炎细胞因子表达、氧化应激以及DNA损伤水平。结果表明:与单独AFB1组相比,含5-Aza-2dc的AFB1组,巨噬细胞的细胞活性和吞噬功能显著升高,而细胞凋亡、促炎细胞因子表达、氧化应激和DNA损伤水平显著下降,说明5-Aza-2dc可以有效缓解AFB1诱导的免疫毒性。综上可知,DNA甲基转移酶在AFB1诱导的免疫毒性中起关键性作用。试验三DNA甲基转移酶参与AFB1诱导的免疫毒性的机制研究试验二结果表明DNA甲基转移酶在AFB1诱导的免疫毒性中起关键性作用,但是其具体机制尚未研究。JAK2/STAT3信号通路是细胞内重要的信号传导通路,有研究表明DNA甲基转移酶可以通过激活该通路参与炎性疾病,同时JAK2/STAT3信号通路是否参与AFB1诱导的免疫毒性的机制尚未研究,因此本试验将JAK2/STAT3信号通路作为切入点研究DNA甲基转移酶参与AFB1诱导的免疫毒性的机制。结果表明:AFB1处理细胞后,磷酸化JAK2和磷酸化STAT3的表达增加,而在用AG490（JAK2的特异性抑制剂）抑制磷酸化的JAK2和STAT3表达后,AFB1诱导的免疫毒性得到有效缓解。此外,与AFB1组相比,含5-Aza-2dc的AFB1组,磷酸化的JAK2和STAT3表达水平亦被显著抑制。说明在抑制了 DNA甲基转移酶后JAK2/STAT3信号通路的活性被抑制。综上可知DNA甲基转移酶通过介导JAK2/STAT3信号通路参与AFB1诱导的免疫毒性。