丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）属黄病毒科，是单股正链RNA病毒，基因组全长约9.6Kb，两端是空间结构保守的非编码区，中间是一个可以编码约3000个氨基酸的多聚蛋白前体的开放阅读框。HCV感染后慢性化程度高，并且可引发严重的肝损伤，进一步导致肝纤维化、肝硬化以及肝细胞癌等严重肝病。HCV被发现后30年以来，随着科学研究的逐渐深入，其防治也取得了一些重要的进展，如小分子直接抗病毒药物的研发取得的重大突破；然而，我们也应该看到目前HCV新药都是由国外研发且价格昂贵，国内绝大多数的慢性 HCV感染者都难以承受。考虑到这些原因以及 HCV感染后病情发展的隐匿性，有效的疫苗对HCV感染的控制仍然极为重要。　　在HCV的防治研究过程中，细胞模型的地位十分重要，它极大的促进了基础研究和新药开发。然而即使目前最常用的肝癌细胞系培养模型也存在感染效率低、不能被临床毒株感染等诸多不足。因此，发展可以较好地支持细胞培养HCV和临床HCV毒株感染并产生与体内感染相似的过程和反应，具有可重复性、可控性和可靠性并符合伦理学要求的细胞模型是目前HCV模型的主要发展方向。理想的细胞模型建立，将为深入研究病毒的致病机制、病毒与宿主相互作用、病毒变异性以及抗病毒药物的筛选和预防疫苗的研究奠定基础。　　本研究基于以上的分析提出：利用具有干细胞功能的人胚胎肝干细胞（human Fatal liver stem cells, hFLSCs）建立高效的血清来源的HCV（blood-borne HCV, bbHCV）培养系统。在此系统中模拟bbHCV体内感染过程中的吸附、侵入、RNA复制、蛋白质合成、病毒组装和分泌以及子代病毒再感染的整个生命过程；利用数学模型阐述病毒在细胞内的增殖和分泌规律；观察类似于HCV慢性感染者体内的细胞病变并初步阐明其机制；利用此系统对已有的抗病毒药物进行效果评价；利用蛋白质组学技术在此系统中发现并验证除目前已有的HCV感染相关受体之外的新的感染关键因子：受体蛋白酪氨酸磷酸酶A（Protein tyrosine phosphatases, receptor type A, PTPRA）和载脂蛋白D（Apolipoprotein D, ApoD），并探讨其在病毒侵入、复制、组装和分泌过程中的机制。主要研究结果如下：　　首先，以目前常用的免疫磁珠分离方法为对照，利用两步原位灌流、IV型胶原酶消化、冰上重力沉淀、Percoll密度梯度离心相结合的方法（简称CSP）分离了高纯度、高增殖活性的hFLSCs。所获得的细胞分离3~5天之后开始增殖呈铺路石样小细胞，10天之后进入对数生长期，而免疫磁珠分离的细胞需要花费2周形成单克隆，第3周才进入对数生长期；并且冻存不影响分离细胞的生长曲线、细胞表面标志物以及基因表达谱。细胞表面标志物表达谱和基因表达谱分析发现两种方法分离的hFLSCs在最初的10代培养过程中并无显著性差异。当细胞传至20代时，免疫磁珠分离的细胞表面 EpCAM、c-kit、CD44和OV-6这几种干细胞标志物的表达明显低于CSP所分离的细胞；两种方法分离的细胞c-kit、EpCAM、CK19、NCAM和CLDN3的mRNA表达谱在细胞传代过程中表现一致，成熟肝细胞特异性基因PEPCK、TRF、CX26和C3A4在两种方法所分离的细胞之间没有显著性差异，AFP和ALB的mRNA表达水平在15到20代之间，免疫磁珠分离细胞较之CSP分离细胞高。体外诱导实验发现 hFLSCs可以定向分化为功能性肝细胞和胆管细胞。　　其次，我们利用hFLSCs建立了一个能完整模拟bbHCV感染细胞并在其中繁殖的整个生命过程的培养系统，可以模拟包括病毒的吸附和侵入、RNA复制、蛋白质合成、病毒组装、有感染性的病毒颗粒的分泌以及特殊的类似于HCV慢性感染者体内的肝细胞病变。利用3D-SIM荧光显微镜展示了HCV E2蛋白和细胞表面CD81受体的结合过程，而其特异的抗体则可以降低病毒的感染效率。此结果表明了hFLSCs可以模拟bbHCV自然感染的吸附和侵入。负链RNA的发现说明了bbHCV可以在hFLSCs中进行RNA的复制，细胞表面特异的HCV蛋白的检出则表明病毒可以在细胞内完成蛋白的翻译合成。进一步的结果还发现hFLSCs可以培养不同基因型的bbHCV（1a,1b,2a和3a型），特别是目前难培养的1b型HCV。病毒RNA复制可以部分的被Peginterferonα-2a和直接抗病毒药物抑制，预示着这个培养系统可以被用于抗病毒药物的筛选和评价。感染后的hFLSCs可以分泌出有感染性的子代病毒颗粒，通过动力学模型计算，我们得出bbHCV在hFLSCs内部的倍增时间大约是2h。利用普通和免疫电子显微镜：在bbHCV感染后的细胞内和培养液中均发现典型的55nm左右的病毒粒子；bbHCV感染可诱导内质网扩张紊乱、线粒体肿胀以及细胞空泡化形成等细胞病变，这些病变和HCV慢性感染者体内的肝细胞病变类似。病变的机制可能为在感染的早期bbHCV诱导ER（Endoplasmic reticulum）应激和线粒体相关的caspase依赖的细胞凋亡；随着时间的延长，NF-κB激活、bcl-XL表达增强，接着PI3-kinase-Akt/PKB细胞增殖通路和 p53抗凋亡通路激活，最终导致细胞凋亡被抑制。同时，我们在bbHCV感染过程中发现固有免疫相关基因ISGs和miRNA（miRNA-21和miRNA-122）均被诱导升高，而敲除或转入miRNA-21或miRNA-122则能抑制或增强bbHCV的复制，此结果表明了hFLSCs可以被用来研究病毒与宿主的相互作用，并为HCV的感染机制研究和治疗提供新思路。　　最后，我们在此基础上利用蛋白质组学技术结合生物信息学分析，最终筛选和发现PTPRA和ApoD与bbHCV感染密切相关。针对目前已经鉴定出的HCV特异性受体CD81、SR-BI、NPC1L1和EGFR，利用siRNA干涉后，可以部分降低bbHCV的感染效率。针对新鉴定的PTPRA和ApoD，bbHCV感染后RT-qPCR检测PTPRA和ApoD的表达发现其明显升高；siPTPRA可以降低病毒进入细胞的量，siApoD则减少了感染后病毒向细胞外分泌的量，但是细胞内病毒 RNA却累积增高；并且 bbHCV感染后可激活胰岛素信号通路，增加IRS和JNK的磷酸化，最终激活Akt导致细胞内脂肪酸合成增加，细胞内脂滴增多。PTPRA抑制剂Peroxyacid可以降低bbHCV及其子代病毒在hFLSCs和Huh-7.5.1中的感染，而PTPRA激动剂胰岛素和TNF-α则作用相反。通过构建PTPRA和ApoD表达质粒（pEGFP-N1），发现bbHCV感染转染PTPRA成功的hFLSCs后，病毒进入细胞的速率增加，达到平台期的时间缩短；而感染转染ApoD的hFLSCs，可以观察到病毒向细胞外分泌的速率增加，细胞外病毒可以在感染后18h到达平台期，较之未转染的24h有显著差异。利用所构建的质粒转染对 bbHCV不感染的肝源 Huh-7和非肝源 vero细胞后发现：Huh-7细胞在转染了PTPRA之后虽然对bbHCV表现出有一定的感染性，但是细胞分泌病毒的含量依然很低，而单独转染ApoD并未对Huh-7感染bbHCV有所改善；有趣的是vero细胞中表达PTPRA可以使这一株完全不感染bbHCV的细胞对bbHCV产生感染性，但可惜的是感染后在细胞上清中只能检测到104~105Copies/mL的病毒RNA。上述结果表明我们发现的PTPRA可能是bbHCV感染必要的一个辅助因子。　　综上所述，本研究致力于建立一个能对bbHCV整个生命过程进行模拟的体外细胞感染模型，解决目前缺乏能稳定、有效模拟bbHCV自然感染过程的细胞模型的关键技术问题，在此基础之上针对bbHCV感染的机制及关键点进行研究。其意义在于有可能打破目前没有能够稳定模拟bbHCV自然感染过程的细胞模型的瓶颈，而且能在病毒在细胞内的繁殖动力学、病毒基因组变异规律研究、抗病毒药物的作用靶点、临床病毒耐药性机制以及建立不同遗传背景的个性化HCV感染细胞模型等研究领域产生理论突破，并为HCV预防疫苗的制备奠定理论与技术基础。