柚木无性系愈伤组织诱导及植株再生

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柚木(Tectona grandis L.f.)属于马鞭草科(Verbenaceae)柚木属(Tectona L.f.)的落叶半落叶性高大乔木,由于其材质优良、用途极广且国际市场对柚木的需求逐年上升等原因,柚木人工林已成为热带地区投资热点。但我国无柚木天然林分布,现存的柚木种质资源基本由国外引进,且现有的柚木林自然条件与原产地相比有一定的差异,在引种栽培上存在着低温霜冻、台风、虫害、病害等困扰。为满足我国柚木推广栽培的需求,选育耐寒、抗病、抗虫、速生的柚木优良品种尤为关键,由于常规育种的选育周期长、难度大、选择效率低,利用转基因技术进行育种已成为柚木新品种创制的一条新途经。而稳定可靠的植株再生体系的建立是进行柚木转基因的前提。自20世纪80年代国内开展的柚木组织培养研究,已形成了成熟的适合规模化生产的组培快繁工艺技术,但尚未建立以愈伤组织诱导的柚木再生体系。本研究在前人研究的基础上,以71-14、71-5无性系无菌组培瓶苗为材料开展了不同基因型、不同植物生长调节剂和不同附加物的柚木愈伤组织诱导等研究,并在此基础上进行了柚木愈伤组织增殖和分化的不同植物生长调节剂处理研究,通过单因素、双因素和多因素的正交设计实验,以期建立高效、稳定的柚木无性系再生体系,为今后柚木无性系转基因提供技术支撑。具体研究结果为:(1)不同基因型诱导效果明显不同。71-14、71-5两个无性系愈伤诱导培养所需生长调节剂的种类以及浓度水平不同。71-14在6-BA低浓度水平下易诱导产生愈伤,71-5在6-BA高浓度水平下更易产生愈伤;IBA易于诱导71-14长根,NAA易于诱导71-5长根;TDZ诱导71-14产生黄绿色致密型愈伤,诱导71-5则产生白色疏松型愈伤。(2)对柚木无性系愈伤组织诱导率影响最大的因素为6-BA,对愈伤状态影响最大的因素为TDZ。71-14诱导愈伤组织的最佳培养基为:MS+0.9mg·L-16-BA+0.04mg·L-1IBA+0.02mg·L-1TDZ+0.8mg·L-1NAA,诱导率高达80.78%,其中致密型愈伤达83%,愈伤平均直径为1.65cm。(3)石蜡切片观察表明:柚木具有增殖能力的胚性愈伤组织以内起源为主,其为浅黄色或浅绿色致密型愈伤组织。(4)从柚木愈伤组织诱导到愈伤增殖和分化需要添加不同的生长调节剂,单一的生长调节剂处理和浓度水平下愈伤分化困难,且极易褐化。影响愈伤继代褐化的主要因素是NAA,其次是6-BA。TDZ仍然是影响愈伤状态和直径大小的因素。继代培养中TDZ最合适的浓度为0.11mg·L-1,愈伤继代培养的较适培养基为:MS+6-BA0.9mg·L-1+IBA0.04mg·L-1+TDZ0.02mg·L-1+NAA0.8mg·L-1。(5)硝酸银对愈伤组织褐化率有显著影响,浓度为0.4mg·L-1时,能有效抑制愈伤的褐化。(6)TDZ对71-14愈伤分化和植株再生有显著影响,高、低浓度水平的TDZ均能诱导愈伤分化产生出芽。最佳愈伤分化和植株再生培养基为MS+0.132mg·L-1TDZ,其分化率和再生系数分别为36.54%和2.23。(7)柚木再生苗从愈伤组织上切离,转入MS+IBA0.04mg·L-1+NAA0.8mg·L-1培养均能生根1~3条,炼苗后移植于基质中,常规管理,即可成活。
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