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苦荞麦(Fagopyrum tataricunm(L.)Gaertn 或者 Tartary buckwheat)又称苦荞,为廖科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum Mill)一年生草本植物。因其含有黄酮类物质,具有抗氧化、抗炎、降血糖、降血脂、降血压、抗肿瘤等多种功能。近年来苦荞麦化学成分研究较多,然而对于苦荞麦中发挥药用价值的主要物质,类黄酮的生物合成途径国内外鲜有报道。黄酮的生物合成调控受到多种因素影响,本研究重点是苦荞bHLH转录因子,对苦荞麦类黄酮生物合成途径的影响。本研究目的是通过对苦荞麦bHLH家族分析及类黄酮生物合成途径中重要基因的克隆和功能分析,探讨苦荞麦类黄酮生物合成途径的调控机制,具体内容如下:1.本研究中利用苦荞麦蛋白组信息在转录因子数据库中注释得到164条苦荞麦bHLH家族序列。使用MEME在线软件分析苦荞bHLH家族结构特征。利用MEGA7.0构建其家族邻接树(Neighbo-Joining,NJ树),把164条bHLH家族序列分为26个亚家族和8个组。使用MeV热图软件直观的表现出它们在各组织器官中表达量的高低。2.利用同源克隆法从苦荞bHLH家族基因中获得3个同源基因,分别命名为 FtbHLH001、FtbHLH003 和 FtbHLH004。4 条核昔酸序列分别包含了 2199bp、1761bp和1887bp的开放读码框,编码的氨基酸分别为732、586和628个。利用基因组信息克隆得到类黄酮合成通路中5个启动子,分别是LAR、F3’H、CHI、F3H、和CHS,对应的长度分别为 1626bp、1784bp、1827bp、1822bp 和 1550bp。3.利用双酶切方法把FtbHLfH001、FtbHLH003和FtbHLH004三个基因构建到酵母双杂交系统的AD和BD载体上。利用Gateway技术将三个目标基因分别构建超表达载体(pK7WG2D)和基因沉默载体(pK7GWIWGIID)。4.把构建完成的3个超表达质粒导入ACCC10060发根农杆菌中,构建成功了 3 个工程菌(FtbHLH001-pK7WG2D-ACCC10060、FtbHLH003-pK7WG2D-ACCC10060 和 FtbHLH004-pK7WG2D-ACCC 10060)。利用工程菌侵染苦荞组织材料获取转基因材料,侵染结果分别获得5、15和20个转基因毛状根材料。