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研究背景及目的睡眠是人类普遍存在且必不可少的一种生理现象,充足的睡眠是维持人体健康的基本保证。然而,随着社会的发展,工作节奏的加快,城市电气化所需的24小时轮班等现象愈发普遍,相当一部分人群主动或被动受到程度不一的睡眠困扰,比如医务人员轮班、司机夜间驾驶、军人执行时敏性军事任务和夜间执勤任务等。上述情况下,人们充足的睡眠或规律的作息无法得到保证,常导致慢性睡眠剥夺的发生。长期的睡眠剥夺会引发人体多系统的负面影响,如易发生神经精神异常、代谢功能紊乱、内分泌功能失调、免疫力下降等。对于心血管系统来说,已有研究提示慢性睡眠剥夺可以导致不同程度的血压升高、心律失常、心脏功能减退等。诚然,避免睡眠剥夺导致健康损伤的最佳方案是保证充足的睡眠,但在上述特殊情况下难以实现。因此,慢性睡眠剥夺情况下有效的心血管保护方案变得尤为重要。钠-葡萄糖共转运体-2（sodium-glucose co-transporter 2,SGLT-2）抑制剂是一类新型口服降糖药物,除了具有良好的降糖效果,还在多项大型临床试验中被证实具有显著的心血管保护作用。然而,在慢性睡眠剥夺情况下,SGLT2抑制剂是否仍能发挥其心血管保护效应,尚无文献报道。因此,本课题的主要目的是对SGLT-2抑制剂达格列净（dapagliflozin,DAPA）对慢性睡眠剥夺小鼠心血管功能障碍的保护作用及机制进行研究。本课题共分为三部分研究,第一部分明确慢性睡眠剥夺对小鼠心血管功能的影响,第二部分探究达格列净对慢性睡眠剥夺小鼠心血管功能的保护作用,第三部分探究达格列净防止慢性睡眠剥夺小鼠心血管功能障碍的机制。第一部分慢性睡眠剥夺对小鼠心血管功能的影响研究方法1.实验分组、建立小鼠慢性睡眠剥夺模型。（1）将8-10周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为对照（Control,Ctrl）组和慢性睡眠剥夺（Sleep Deprivation,SD）组。（2）将SD组小鼠置于KW-BD大小鼠睡眠剥夺仪中,设定中央横杆转速为4圈/分钟,每24小时转动18小时、停止6小时,持续28天,以此建立慢性睡眠剥夺模型。将Ctrl组小鼠置于另一个相同的KW-BD大小鼠睡眠剥夺仪中,横杆保持静止,持续28天。（3）在造模过程中,保证小鼠的自由饮食饮水,及时更换垫料,保持小鼠生活环境干燥卫生。2.观察小鼠一般情况、监测小鼠心血管功能相关指标（1）观察小鼠毛色、精神状态、活动度等一般情况。（2）监测小鼠体重（body weight,BW）、心脏重量（heart weight,HW）、心重/体重比值（HW/BW）、血糖（blood glucose）、心率（heart rate,HR）、血压、心脏功能、冠脉微循环功能,评估慢性睡眠剥夺对小鼠心血管功能的影响。（3）留取心脏组织标本,制作病理切片,行HE染色、Masson染色、ROS探针-DHE荧光及CD31免疫组化,评估慢性睡眠剥夺小鼠心脏组织病理改变、心肌纤维化程度、氧化应激水平和毛细血管密度的情况。研究结果1.慢性睡眠剥夺使小鼠体重明显下降（1）相较于Ctrl组,SD组小鼠BW明显下降（p＜0.05）。（2）Ctrl组与SD组小鼠HW、HW/BW比值、血糖水平无明显差异。2.慢性睡眠剥夺导致小鼠血压升高（1）相较于Ctrl组,SD组小鼠收缩压（systolic blood pressure,SBP）、舒张压（diastolic blood pressure,DBP）、平均动脉压（mean arterial pressure,MAP）均显著升高（p＜0.01）。（2）Ctrl组与SD组小鼠HR无明显区别。3.慢性睡眠剥夺导致小鼠心脏舒张功能障碍（1）相较于Ctrl组,SD组小鼠E/A比值显著降低、E峰下降时间（descending time,DT）、等容舒张时间（isovolumic relaxation time,IVRT）均显著延长（p＜0.01）。（2）Ctrl组与SD组小鼠左室射血分数（left ventricular ejection fracture,LVEF）、缩短分数（fractional shortening,FS）、室间隔厚度（interventricular septal thickness,IVST）、左室内径（left ventricular internal diameter,LVID）、左室后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness,LVPW）均无明显差异。4.慢性睡眠剥夺导致小鼠冠脉微循环障碍（1）相较于Ctrl组,SD组小鼠冠脉血流储备（coronary flow reserve,CFR）显著降低（p＜0.01）。（2）相较于Ctrl组,SD组小鼠心脏毛细血管密度显著下降（p＜0.01）。5.慢性睡眠剥夺导致小鼠心脏组织炎症浸润等改变。（1）Ctrl组小鼠心肌细胞排列较整齐,未见明显坏死和断裂,未见明显炎性细胞浸润灶,未见明显心肌纤维化表现。（2）SD组小鼠心肌纤维排列较紊乱,成纤维细胞增多,毛细血管充血,间质出血,间质可见散在的炎性细胞浸润,局部可见心肌纤维断裂,细胞空泡变性。6.慢性睡眠剥夺导致小鼠心脏组织氧化应激水平升高相较于Ctrl组,SD组小鼠心脏组织ROS探针-DHE荧光强度显著升高（p＜0.01）。7.慢性睡眠剥夺导致小鼠心脏纤维化程度加重相较于Ctrl组,SD组小鼠心脏组织Masson染色提示心肌纤维化程度显著加重（p＜0.01）。研究结论慢性睡眠剥夺可导致小鼠血压升高、心脏舒张功能下降及冠脉微循环障碍,组织病理提示心脏组织氧化应激以及心肌纤维化程度加重。第二部分达格列净对慢性睡眠剥夺小鼠心血管功能的保护作用研究方法1.实验分组及模型建立（1）将C57BL/6小鼠随机分为对照（Ctrl）组、睡眠剥夺（SD）组、达格列净（DAPA）组和睡眠剥夺+达格列净（SD+DAPA）组。（2）分别将SD组和SD+DAPA组小鼠置于两个相同的KW-BD大小鼠睡眠剥夺仪中进行慢性睡眠剥夺,睡眠剥夺仪参数设置与第一部分实验相同。Ctrl组和DAPA组小鼠置于相同的睡眠剥夺仪中,不进行睡眠剥夺。（3）在造模同时,对DAPA组和SD+DAPA组小鼠按照1mg/kg/d达格列净进行灌胃干预,对Ctrl组和SD组小鼠等剂量对照溶剂灌胃。2.各组小鼠心血管功能评价造模结束后评估各组小鼠的心血管功能（血压、心率、冠脉微循环、心脏功能）。研究结果1.达格列净有效防止慢性睡眠剥夺小鼠血压升高相较于SD组,SD+DAPA组小鼠SBP、DBP、MAP均显著降低（p＜0.01）,HR无明显变化。2.达格列净有效防止慢性睡眠剥夺小鼠心脏舒张功能障碍相较于SD组,SD+DAPA组小鼠心脏舒张功能指标E/A比值显著升高,DT、IVRT均显著缩短（p＜0.01）,心脏收缩功能指标LVEF、FS、IVST、LVID、LVPW均无明显差异。3.达格列净有效防止慢性睡眠剥夺小鼠冠脉微循环障碍相较于SD组,SD+DAPA组小鼠CFR显著升高（p＜0.01）。4.达格列净对普通（无睡眠剥夺）小鼠心血管功能无明显影响（1）DAPA组与Ctrl组小鼠血压（SBP、DBP、MAP）及心率均无明显差异。（2）DAPA组与Ctrl组小鼠心脏舒张功能指标E/A比值、DT、IVRT及收缩功能指标LVEF、FS、IVST、LVID、LVPW均无明显差异。（3）DAPA组与Ctrl组小鼠CFR水平无明显差异。研究结论达格列净可有效防止慢性睡眠剥夺导致小鼠血压升高、冠脉微循环障碍、心脏舒张功能障碍等心血管功能障碍。第三部分达格列净改善慢性睡眠剥夺小鼠心血管功能障碍的机制研究研究方法1.检测各组小鼠心脏组织氧化应激水平和心肌纤维化程度（1）在第二部分实验基础上,留取各组小鼠心脏标本。（2）行组织切片HE染色、Masson染色、ROS探针-DHE荧光检测。2.检测各组小鼠心脏组织TGF-β/Smad通路蛋白表达含量行Western blot,检测心脏组织TGF-β1、Smad 3、p-Smad 3表达水平。实验结果1.达格列净有效防止慢性睡眠剥夺小鼠心脏炎症浸润等病理变化（1）相较于SD组,SD+DAPA组小鼠心肌细胞排列相对整齐,坏死、断裂等显著减少,炎性细胞浸润明显减少。（2）DAPA组与Ctrl组小鼠心脏组织HE染色未见明显差异。2.达格列净有效防止慢性睡眠剥夺小鼠心脏组织氧化应激水平升高（1）相较于SD组,SD+DAPA组小鼠心脏组织ROS探针-DHE荧光水平显著降低（p＜0.01）。（2）SD+DAPA组、DAPA组与Ctrl组的心脏组织ROS探针-DHE荧光水平无明显差异。3.达格列净有效防止慢性睡眠剥夺小鼠心肌纤维化程度加重（1）Masson染色提示:相较于SD组,SD+DAPA组小鼠心肌纤维化程度显著降低（p＜0.01）。（2）SD+DAPA组、DAPA组与Ctrl组小鼠心肌纤维化水平无明显差异。4.达格列净可抑制慢性睡眠剥夺导致的心脏TGF-β/Smad通路表达上调（1）Western-blot结果显示:相较于Ctrl组,SD组小鼠心脏TGF-β、p-Smad3/Smad3表达水平显著升高（p＜0.01）。（2）Western-blot结果提示:相较于SD组,SD+DAPA组小鼠心脏TGF-β、p-Smad3/Smad3表达水平显著降低（p＜0.01）。（3）Western-blot结果提示:SD+DAPA组、DAPA组与Ctrl组小鼠心脏TGF-β、p-Smad3/Smad3表达水平无明显差异。研究结论1.达格列净有效防止慢性睡眠剥夺导致的心脏病理改变、心脏氧化应激水平升高、心肌纤维化程度加重。2.达格列净可通过抑制TGF-β/Smad通路减轻慢性睡眠剥夺导致的心肌纤维化。