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目的人类获得性免疫缺陷综合征是一种危害极大的传染病,其主要的病原体是HIV-1型病毒,目前仍在全球广泛流行,HIV感染者的新发病例数逐年上升,目前全世界仍有超过3800万的病例数,艾滋病仍然是严重威胁人类健康的世界重大公共卫生问题。HIV病毒主要攻击处于免疫调控核心地位的CD4+T细胞及树突状细胞、单核/巨噬细胞和其他免疫细胞,最终造成机体免疫系统的全面崩溃,由于机体抵抗力极度低下,会造成身体多重感染,最终导致死亡。再加之污名化、歧视以及其他社会不平等和社会排斥等社会心理因素,极大的加重患者的身心负担。目前针对AIDS的防治策略仍然是预防为主,对于感染者主要是通过使用高效抗逆转录病毒疗法,尽最大限度和持久的降低病毒载量,获得免疫功能重建和维持免疫功能,提高生活质量,降低HIV相关的发病率和死亡率。然而,均无法达到根治的效果,并且一旦停止服用抗病毒药物,患者体内的病毒就会迅速反弹,迄今还没有一种策略能够彻底治愈,也没有可用于预防的有效疫苗。因此深入探究HIV病毒的致病机制及宿主的抗HIV病毒的作用机理,是开发新的治疗药物和研发有效疫苗的前提和基础。HIV-1病毒的整合是病毒生活史中非常重要的阶段,病毒的c DNA必须插入宿主细胞的染色体中,才能建立了一个永久性的遗传储存库,启动新的病毒粒子产生,逃避免疫监视,并通过宿主细胞有丝分裂进行复制。因此,将病毒有效的阻隔在整合阶段,对艾滋病的治疗具有非常重要的意义。HIV病毒DNA的整合是由整合酶介导的,在没有整合酶参与时HIV病毒的整合不能发生,而目前尚未发现与整合相关的重要宿主限制因子,因此本研究立足于病毒整合酶筛选与之相互作用的宿主抗病毒因子,并深入探索其抗病毒的作用及机制,为认识HIV病毒与宿主相互作用机制奠定理论基础,为艾滋病的临床治疗提供新的潜在靶标和新思路。研究方法1.通过HIV-1型NL4-3-Luc假病毒感染Jurkat T细胞,收集蛋白样本,用抗整合酶或无关的Ig G抗体进行免疫沉淀与其相互作用的蛋白,并用液相色谱-质谱联用（LC-MS）对沉淀蛋白进行进一步鉴定,并进一步筛选具有抗HIV-1病毒功能的分子。2.在293T细胞系、Jurkat T细胞系和原代激活CD4+T细胞或静息的CD4+T细胞中,使用CTNNBL1过表达或si RNA/sh RNA/sg RNA敲减CTNNBL1的表达,探究外源或内源表达的CTNNBL1对HIV-1/HBV/MLV等不同病毒的抗病毒作用。3.通过荧光定量PCR检测HIV-1的late RT、Alu-PCR和2-LTR,探究CTNNBL1对HIV-1抗病毒的作用阶段是否为病毒的整合阶段。4.通过co-IP实验探究CTNNBL1与HIV-1整合酶及LEDGF是否相互作用,其相互作用是否依赖于HIV病毒的感染及其病毒的核酸或细胞的激活状态。5.在LEDGF/p75缺失和LEDGF/p75野生型的293T细胞中分别过表达MYC-CTNNBL1或Mock对照质粒,感染HIV-1NL4-3-Luc（VSV-G）假病毒,检测细胞的荧光素酶活性以及IP实验检测CTNNBL1与HIV-1整合酶及LEDGF的相互作用情况,探究CTNNBL1与HIV-1整合酶相互作用以及抗病毒功能是否依赖于LEDGF/p75。6.构建CTNNBL1截短质粒,转染293T细胞,探究CTNNBL1发挥抗病毒作用和与LEDGF/p75相互作用的结构域。7.通过western blot技术检测HIV-1NL4.3野生型病毒感染或不感染激活的CD4+T细胞或Jurkat细胞时,CTNNBL1的蛋白表达变化,探究病毒感染对CTNNBL1表达的影响。8.使用蛋白酶抑制剂MG132处理细胞,结合蛋白酶体泛素化降解系统,探究HIV病毒感染降解CTNNBL1的机制。9.收集健康志愿者、HIV感染未治疗患者和治疗患者的外周血,分离CD4+T细胞提取细胞总RNA,荧光定量PCR检测CTNNBL1的表达,比较CTNNBL1在不同组间转录水平的表达差异;同时收集未治疗患者的外周血CD4+T细胞数量、CD4/CD8比率和病毒载量数据,分析CTNNBL1的表达与未治疗患者CD4数量、CD4/CD8比率和病毒载量的临床相关性。10.收集未治疗患者的外周血,分离CD4+T细胞,使用CD3/CD28+IL2激活细胞,使用CTNNBL1慢病毒包装的sh RNA敲减CTNNBL1的表达,探究患者体内CD4+T细胞中内源性表达的CTNNBL1与病毒增值的相关性。11.收集未治疗患者的外周血,分离CD4+T细胞,使用CD3/CD28+IL2激活细胞,在逆转录酶抑制剂Efavirenz存在或不存在的情况下培养细胞,检测CTNNBL1的表达差异,探究患者体内CD4+T细胞中病毒的连续感染对CTNNBL1表达的影响。结果1.通过HIV-1病毒整合酶IP沉淀获得了CNBP、CTNNBL1、LEDGF、HNRNPL和MAPRE1这5种蛋白质,但只有CTNNBL1具有抗病毒功能。2.在293T细胞过表达CTNNBL1能显著抑制HIV-1NL4.3病毒和HIV-2Rod病毒的感染能力,对SIVmac239也有一定的拮抗作用,但对HBV几乎没有抑制作用;在Jurkat T细胞系和原代激活CD4+T细胞或静息的CD4+T细胞中,分别使用CTNNBL1 si RNA或sh RNA和sg RNA敲减CTNNBL1的表达,HIV病毒复制能力明显增加。3.CTNNBL1的存在极大地降低了293T细胞中HIV-1的整合,增加了2-LTR环状DNA的水平,总c DNA没有受到影响;CTNNBL1的缺失促进了HIV-1的整合,降低了293T细胞、Jurkat细胞以及原代激活CD4+T细胞和静息CD4+T细胞中2-LTR环状DNA水平,而无论在有没有CTNNBL1存在的情况下,病毒晚期逆转录水平都保持不变。4.CD4+T细胞激活后CTNNBL1的相对表达量明显降低,CTNNBL1表达量在生理状态下可能与CD4+T细胞的激活状态有关。5.CTNNBL1与LEDGF/p75的相互作用,不依赖于HIV病毒感染或细胞的激活状态,也不依赖于HIV病毒的RNA或前病毒DNA。6.在LEDGF/p75表达缺失的293T细胞中,CTNNBL1不能与整合酶发生相互作用,过表达或敲减CTNNBL1的表达对HIV-1病毒的整合也没有明显影响,提示,CTNNBL1与整合相互作用及抗病毒作用是通过与整合酶的辅助因子LEDGF/p75相互作用实现的。7.CTNNBL1的C端而不是N端对其抗病毒功能和结合LEDGF/p75具有重要影响,CTNNBL1是通过其C端与LEDGF/p75相互作用的,CTNNBL1介导的对HIV-1病毒整合的抑制作用依赖于其C端结构域与病毒整合酶辅助因子LEDGF/p75的相互作用。8.HIV-1感染靶细胞后,细胞内的CTNNBL1的蛋白水平显著降低,而RNA水平与未感染病毒的细胞相比没有明显变化,提示病毒可能通过细胞固有免疫或者细胞信号网络机制,诱导靶细胞降低CTNNBL1蛋白,进而成功造成细胞的感染和病毒的复制。9.蛋白酶抑制剂MG132能抑制HIV-1病毒感染靶细胞后CTNNBL1蛋白的降解,HIV-1病毒感染靶细胞后,细胞是通过蛋白酶体-泛素化降解途径降解CTNNBL1蛋白的。10.在健康志愿者、HIV感染未治疗患者和HAART治疗患者中,CTNNBL1的转录水平没有明显差异;在未治疗患者CD4+T细胞中,CTNNBL1的表达水平与患者病毒载量呈负相关,与外周血CD4+T细胞数量和CD4+T/CD8+T细胞比率无相关性;11.在未治疗患者CD4+T细胞中敲减CTNNBL1的表达,产生的病毒明显增加,且与CTNNBL1表达呈负相关;12.在HIV感染者外周血CD4+T细胞中,病毒的传播感染会造成CTNNBL1蛋白水平的降低。结论1.CTNNBL1是HIV病毒的负性调控因子,其发挥作用的阶段为病毒的整合阶段。2.CTNNBL1是通过其C端结构域与LEDGF/p75相互结合,进而与整合酶相互作用最终发挥抗病毒功能的;HIV病毒感染宿主细胞后通过诱导蛋白酶体泛素化降解途径降解CTNNBL1,进而拮抗CTNNBL1的抗整合功能。3.CTNNBL1与HIV病毒感染者存在疾病进展相关性,HIV感染未治疗患者CD4+T细胞中CTNNBL1的表达水平与病毒载量呈负相关,病毒的复制水平与CTNNBL1表达具有负相关性,而病毒的感染导致CTNNBL1降解。