高山被孢霉具有优异的多不饱和脂肪酸合成能力,是一株具有广阔发展前景的产油丝状真菌,为了适应工业化生产多不饱和脂肪酸需要进一步提高其脂质积累能力。以海藻糖为主的糖类合成是高山被孢霉中除脂质外另一主要的碳储备方式,与脂质合成途径竞争碳通量,而糖异生途径会造成脂肪酸合成所需的丙酮酸分流并将碳通量导入糖类合成中。本研究以改善碳通量在糖类与脂质合成中的重新分配以促进脂质积累为目的,对海藻糖合成关键步骤中的海藻糖-6-磷酸合成酶编码基因（Matps）与糖异生关键步骤中的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因（Mapepck）进行RNA干扰,对重组菌基因转录水平、酶活水平以及生长与糖类、脂质代谢等进行分析,研究高山被孢霉糖代谢相关基因在氮限制下对其糖、脂代谢的作用,并分别对干扰菌株在环境胁迫中的响应情况以及发酵罐放大培养中糖、脂积累差异进行研究。本文为解析干扰高山被孢霉中的Matps基因与Mapepck基因在脂质积累过程中对碳源进行分配的影响以及提高菌株的脂质积累能力提供了理论依据,主要研究内容如下。1、建立高山被孢霉中糖类的提取与分析方法,比较3种加热浸提与3种循环冻融提取方法,确定盐酸加热浸提结合苯酚-硫酸法测定总糖,乙腈-水循环冻融提取后通过高效液相色谱法结合蒸发光散射检测器对糖类成分进行分析,使用上述两种方法对高山被孢霉发酵过程分析,结果表明高山被孢霉在脂质积累过程中可同步积累高水平糖类物质,总糖含量最高可达菌体干重的26%,主要糖类成分海藻糖比重超过总糖的20%。糖类的合成是脂质合成的主要竞争途径,其中含量最高的海藻糖或许能够作为干扰糖类积累的有效靶点,此外为总糖积累提供碳源的糖异生途径可能是另一个有效的干扰目标。2、通过生物信息学分析了高山被孢霉中海藻糖合成相关的Matps基因与糖异生相关的Mapepck基因,通过根癌农杆菌介导转化法与RNA干扰技术构建Matps基因与Mapepck基因的重组菌。Matps基因干扰菌株中Matps基因转录水平下降约60%,Mapepck基因干扰菌株中Mapepck基因转录水平下降约41%,Ma PEPCK蛋白酶活水平下降约45%,表明RNA干扰成功在基因和蛋白水平削弱了相关途径的表达。3、在发酵后期,Matps基因的干扰导致高山被孢霉中主要糖类成分海藻糖的含量下调37%,而脂肪酸含量最大提高了20%,但后期ARA产量提高30%。说明在氮限制条件下通过RNAi下调Matps基因的表达可以降低海藻糖积累量,并且将一部分碳代谢流转移至脂肪酸合成;在面对轻微胁迫条件时,Matps基因主要起到控制碳通量分流作用,而在严重胁迫条件下,由于海藻糖抵抗胁迫的能力不可忽视,Matps基因的正常表达对胁迫状态下维持菌株活性有重要作用。4、脂质积累过程中,干扰高山被孢霉的Mapepck基因导致胞内总糖含量下调17%～28%,脂质含量提高了17%～26%,后期ARA产量提高近42%。与干扰Matps不同,干扰Mapepck基因虽然改变了碳代谢流在胞内糖、脂代谢途径中的分布,但未影响海藻糖在总糖中的比重,说明干扰Mapepck基因降低了糖异生水平并导致总糖水平下降从而促进脂质的积累;对重组菌株的代谢物分析表明,Mapepck基因表达下调了除了减少糖异生向糖类合成输送碳流,还加速了丙酮酸-柠檬酸循环促使脂肪酸合成前体的产生;最后在发酵罐放大培养过程中验证了Mapepck基因干扰菌株的脂质积累能力,结果表明干扰Mapepck基因不仅提高了脂肪酸产量,还能使菌株提前到达脂质最大积累时间,相比于出发菌株更具有产脂优势。对糖、脂积累的解析有利于优化高山被孢霉中碳代谢流的分配,为通过调控高山被孢霉糖类合成来促进脂质合成提供理论依据。