论文部分内容阅读
偶氮染料是目前应用最为广泛、品种最多的一类合成染料，但是相关报道证明其具有致癌性和致突变性。因此，迫切需要开发经济有效的技术来充分脱色和降解染料及其在印染废水处理后残留的中间体。已有大量的研究表明了细菌在处理印染废水过程中发挥了重要作用。其中，由不同菌株组成、结构复杂的微生物菌群具有不同菌株分解代谢多样性的互补性以及对外界环境的强适应性，进而使得微生物菌群在印染废水处理过程中的应用具有明显的优势。目前，共代谢作为一种发展前景广阔的生物技术，已被广泛应用于提高对难降解污染物的生物去除性能。其中，向微生物系统中投加糖源作为共基质可大大增强对偶氮染料的生物处理能力。但是，针对相互关联的糖源作为共基质的比较研究则很少，而针对菌群/菌种共代谢降解偶氮染料的效能差异机制以及内在分子机制的深入研究则更少。因此，本论文选择在代谢水平上互为关联的三种不同糖类物质组合成四种不同糖源作为共基质，分别为：蔗糖（二糖，可分解为一分子葡萄糖和一分子果糖）、葡萄糖（单糖）、果糖（单糖）、葡萄糖+果糖。以天然功能菌群DDMZ1为菌群来源，以高毒性双偶氮染料活性黑5为目标污染物，采用静置培养方式，进行一系列静态批次实验。细致研究在糖源的共代谢作用下染料的降解动力学、偶氮还原酶活性、微生物菌群结构响应机制、功能基因和功能蛋白质差异表达机制等。本文所开展的主要研究如下：
（1）功能菌群筛选及其生物学特性研究
通过浓度梯度压力驯化法从活性污泥中筛选驯化出对偶氮染料活性黑5具有高效脱色降解性能的功能菌群DDMZ1，经扫描电子显微镜观察可知该菌群中优势菌为杆状菌。考察培养方式、pH、温度、盐浓度以及初始活性黑5浓度对功能菌群DDMZ1脱色的影响来解析其生物学特性。结果表明，在pH=5.5、温度为37℃的静置（兼氧）培养条件下，功能菌群DDMZ1对RB5的脱色降解效果最好。此外，功能菌群DDMZ1具有一定的耐盐性，对高浓度活性黑5仍表现出较高的脱色降解能力。
（2）功能菌群利用不同糖源共代谢脱色降解活性黑5效能差异机制研究
研究四种互为关联的糖源（葡萄糖、果糖、蔗糖、葡萄糖+果糖）作为共基质对功能菌群DDMZ1脱色降解活性黑5的效能差异机制，考察了四种糖源对功能菌群DDMZ1脱色活性黑5的降解动力学、偶氮还原酶活性、降解产物以及微生物群落结构等方面的影响。结果表明，四种互为关联的糖源作为共基质促进了功能菌群DDMZ1对活性黑5的脱色降解，其中果糖在所选糖源中是最佳共基质。在四个糖源共代谢体系中，不同初始浓度活性黑5的去除遵循一级动力学模型。四种糖源的添加均促进了偶氮还原酶活性，其中添加果糖的样品表现出最高的偶氮还原酶活性。LC-TOF-MS鉴定结果表明，活性黑5在四种糖源体系中被生物降解成分子量更小且结构更简单的代谢产物，且添加果糖的样品比其他糖源样品代谢形成的降解产物更多。高通量测序结果显示，在添加果糖的样品中除了显著优势菌属Burkholderia-Paraburkholderia外，还富集了Klebsiella，推测这两种优势菌属在功能菌群DDMZ1脱色降解活性黑5过程中发挥了重要作用。
（3）果糖共代谢作用下功能菌群基因组和蛋白质组响应机制研究
研究在最佳糖源——果糖的共代谢作用下，功能菌群基因组和蛋白质组的响应机制以及功能菌群DDMZ1脱色降解活性黑5的内在强化机制。采用宏基因组测序技术对基因集进行了物种注释以及相关的功能注释，进而分析了在果糖共代谢作用下功能菌群DDMZ1基因组的响应机制。编码NADH:ubiquinone reductase、NADPH:quinone reductase、FMN-dependent NADH-azoreductase等蛋白质合成的相关基因被认为是功能基因。Label free无标记定量蛋白质组学测序方法进一步验证了功能基因编码的上调功能蛋白质/酶。GO功能注释结果表明，某些上调蛋白质与活性黑5生物降解的还原、环裂解以及中间代谢产物跨膜过程相关。Benzoate degradation通路被认为与活性黑5降解联系最紧密。一些上调蛋白质中的氧化还原酶、脱氢酶/还原酶和外膜蛋白被认为在果糖共代谢体系中对活性黑5的生物降解发挥了重要作用。将宏基因组和宏蛋白质组进行联合分析，两者的GO功能注释、KEGG通路注释等结果在基因和蛋白质水平表现出了较大的相关性与一定的差异性。基于优势菌属Pseudomonas和Burkholderia与功能基因以及功能蛋白质之间的相关性，提出了染料活性黑5的分子降解机制。
（4）功能菌种分离鉴定及其生物学特性研究
从功能菌群DDMZ1中分离获得两株功能菌种，经鉴定分别命名为Burkholderiastrain DDMZ1-1和Pseudomonas aeruginosastrain DDMZ1-2。考察pH、温度以及盐浓度对功能菌种脱色活性黑5的影响来解析其生物学特性，结果表明，在pH=5.5、温度为37℃的培养条件下，这两个功能菌种对活性黑5的脱色降解效果最好，但均低于功能菌群DDMZ1在该最适培养条件下对活性黑5的脱色效率。此外，两个功能菌种均具有一定的耐盐性，可以应用于具有高盐度的染料废水处理过程中。果糖的添加能够显著提升两个功能菌种对不同初始浓度活性黑5的脱色性能以及偶氮还原酶活性，这与之前果糖显著刺激功能菌群DDMZ1脱色降解活性黑5以及分泌偶氮还原酶的研究结果一致。利用荧光定量PCR技术对选定的偶氮还原酶基因azoR3进行定量分析，结果表明，azoR3在功能菌种Pseudomonasaeruginosastrain DDMZ1-2中的定量值显著高于Burkholderiastrain DDMZ1-1，且果糖的添加能显著刺激该偶氮还原酶基因的表达。此外，果糖作为共基质能够显著提升不同浓度配比的两个功能菌种对活性黑5的脱色效果，而两个功能菌种对不同结构染料也表现出了较强的广谱降解性能。
本论文揭示了在代谢水平上互为关联的糖源条件下引起共代谢效能差异的功能菌群、功能菌种、关键酶活、功能基因和功能蛋白与糖源之间的相互作用关系。研究结果为难降解有机污染物的生物修复技术提供了新的思路，同时为原位强化和有效调控含偶氮染料废水生物脱色提供理论依据。
（1）功能菌群筛选及其生物学特性研究
通过浓度梯度压力驯化法从活性污泥中筛选驯化出对偶氮染料活性黑5具有高效脱色降解性能的功能菌群DDMZ1，经扫描电子显微镜观察可知该菌群中优势菌为杆状菌。考察培养方式、pH、温度、盐浓度以及初始活性黑5浓度对功能菌群DDMZ1脱色的影响来解析其生物学特性。结果表明，在pH=5.5、温度为37℃的静置（兼氧）培养条件下，功能菌群DDMZ1对RB5的脱色降解效果最好。此外，功能菌群DDMZ1具有一定的耐盐性，对高浓度活性黑5仍表现出较高的脱色降解能力。
（2）功能菌群利用不同糖源共代谢脱色降解活性黑5效能差异机制研究
研究四种互为关联的糖源（葡萄糖、果糖、蔗糖、葡萄糖+果糖）作为共基质对功能菌群DDMZ1脱色降解活性黑5的效能差异机制，考察了四种糖源对功能菌群DDMZ1脱色活性黑5的降解动力学、偶氮还原酶活性、降解产物以及微生物群落结构等方面的影响。结果表明，四种互为关联的糖源作为共基质促进了功能菌群DDMZ1对活性黑5的脱色降解，其中果糖在所选糖源中是最佳共基质。在四个糖源共代谢体系中，不同初始浓度活性黑5的去除遵循一级动力学模型。四种糖源的添加均促进了偶氮还原酶活性，其中添加果糖的样品表现出最高的偶氮还原酶活性。LC-TOF-MS鉴定结果表明，活性黑5在四种糖源体系中被生物降解成分子量更小且结构更简单的代谢产物，且添加果糖的样品比其他糖源样品代谢形成的降解产物更多。高通量测序结果显示，在添加果糖的样品中除了显著优势菌属Burkholderia-Paraburkholderia外，还富集了Klebsiella，推测这两种优势菌属在功能菌群DDMZ1脱色降解活性黑5过程中发挥了重要作用。
（3）果糖共代谢作用下功能菌群基因组和蛋白质组响应机制研究
研究在最佳糖源——果糖的共代谢作用下，功能菌群基因组和蛋白质组的响应机制以及功能菌群DDMZ1脱色降解活性黑5的内在强化机制。采用宏基因组测序技术对基因集进行了物种注释以及相关的功能注释，进而分析了在果糖共代谢作用下功能菌群DDMZ1基因组的响应机制。编码NADH:ubiquinone reductase、NADPH:quinone reductase、FMN-dependent NADH-azoreductase等蛋白质合成的相关基因被认为是功能基因。Label free无标记定量蛋白质组学测序方法进一步验证了功能基因编码的上调功能蛋白质/酶。GO功能注释结果表明，某些上调蛋白质与活性黑5生物降解的还原、环裂解以及中间代谢产物跨膜过程相关。Benzoate degradation通路被认为与活性黑5降解联系最紧密。一些上调蛋白质中的氧化还原酶、脱氢酶/还原酶和外膜蛋白被认为在果糖共代谢体系中对活性黑5的生物降解发挥了重要作用。将宏基因组和宏蛋白质组进行联合分析，两者的GO功能注释、KEGG通路注释等结果在基因和蛋白质水平表现出了较大的相关性与一定的差异性。基于优势菌属Pseudomonas和Burkholderia与功能基因以及功能蛋白质之间的相关性，提出了染料活性黑5的分子降解机制。
（4）功能菌种分离鉴定及其生物学特性研究
从功能菌群DDMZ1中分离获得两株功能菌种，经鉴定分别命名为Burkholderiastrain DDMZ1-1和Pseudomonas aeruginosastrain DDMZ1-2。考察pH、温度以及盐浓度对功能菌种脱色活性黑5的影响来解析其生物学特性，结果表明，在pH=5.5、温度为37℃的培养条件下，这两个功能菌种对活性黑5的脱色降解效果最好，但均低于功能菌群DDMZ1在该最适培养条件下对活性黑5的脱色效率。此外，两个功能菌种均具有一定的耐盐性，可以应用于具有高盐度的染料废水处理过程中。果糖的添加能够显著提升两个功能菌种对不同初始浓度活性黑5的脱色性能以及偶氮还原酶活性，这与之前果糖显著刺激功能菌群DDMZ1脱色降解活性黑5以及分泌偶氮还原酶的研究结果一致。利用荧光定量PCR技术对选定的偶氮还原酶基因azoR3进行定量分析，结果表明，azoR3在功能菌种Pseudomonasaeruginosastrain DDMZ1-2中的定量值显著高于Burkholderiastrain DDMZ1-1，且果糖的添加能显著刺激该偶氮还原酶基因的表达。此外，果糖作为共基质能够显著提升不同浓度配比的两个功能菌种对活性黑5的脱色效果，而两个功能菌种对不同结构染料也表现出了较强的广谱降解性能。
本论文揭示了在代谢水平上互为关联的糖源条件下引起共代谢效能差异的功能菌群、功能菌种、关键酶活、功能基因和功能蛋白与糖源之间的相互作用关系。研究结果为难降解有机污染物的生物修复技术提供了新的思路，同时为原位强化和有效调控含偶氮染料废水生物脱色提供理论依据。