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目的:通过构建气虚疲劳小鼠模型,探究人参水煎剂及其microRNA对气虚疲劳小鼠的干预作用,探讨人参miRNA作为一种药效物质的可能性及人参补气抗疲劳作用中其miRNA跨界调控的可能机制。方法:1、部分人参水煎剂miRNAs验证:根据前期从人参水煎剂高通量测序鉴定出来的miR159,miR166,miR5072,miR5658和miR8175序列,设计并合成相应的反转录引物及扩增引物,通过RT-qPCR确认人参水煎剂RNA中确实存在这几种miRNA。2、气虚疲劳小鼠模型负重力竭游泳实验:120只昆明小鼠分为10组(空白组-BC、模型组-MD、人参水煎剂组-GD、人参水煎剂加酶组-NC、人参total RNA组-RNA、miR159组-159、miR166组-166、miR5072组-5072、mi R5658组-5658、miR8175组-8175),每组12只,通过限制日摄食量+负重力竭游泳构建气虚疲劳小鼠模型,连续21天。制备人参水煎剂、加入RNase的人参水煎剂、人参total RNA,设计合成miR159,miR166,miR5072,miR5658和mi R8175相对应的mimic,分别灌胃各组小鼠,每日一次,连续21天。第22天,取各材,检测小鼠血清的尿素氮(BUN)、乳酸脱氢酶(LDH)、肝糖原与肌糖原、肝脏的超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)、肌肉的ATP酶含量等生化指标。酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清炎症因子白介素-4(IL-4)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。3、小鼠血液中人参miRNAs鉴定及靶基因预测:将灌胃人参水煎剂的小鼠血液用Trizol法提取RNA后,经琼脂糖凝胶电泳、NanoDrop及Agient 2100 Bioanalyzer检测总RNA纯度及完整性。利用Illumina HiSeq~TMM 2500测序仪进行small RNA高通量测序,鉴定其中存在的人参miRNA。对鉴定出的人参miRNA进行靶基因预测,并进行GO及KEGG富集分析。4、小鼠脏器组织中部分人参mi RNA验证及靶基因表达:取模型组(MD)、人参水煎剂组(GD)、人参水煎剂加酶组(NC)和人参total RNA组(RNA)的血液、脾脏和胸腺分别进行miR159,mi R166,和mi R8175的RT-qPCR验证。同时,利用RT-q PCR检测气虚疲劳小鼠血液、脾脏和胸腺中相关免疫基因的表达变化。结果:1、从制备的人参水煎剂中提取到RNA,通过RT-q PCR检测目标mi RNA,发现人参水煎剂总RNA中确实能检测到mi R159,miR166,miR5072,miR5658和miR8175,验证了前期高通量测序结果,为后续研究奠定了可靠基础。2、与空白组小鼠相比,模型组小鼠活动量降低,呈现出疲劳特性,体重、力竭游泳时间、肝糖原、肌糖原含量、SOD活力显著降低,BUN水平、MDA含量显著升高,表明本实验成功建立气虚疲劳小鼠模型。人参水煎剂组、人参total RNA组、miR159组、miR166组、miR5072组和miR5658组小鼠力竭游泳时间、肝糖原、肌糖原含量较模型组升高,BUN水平下降、LDH活力增加,显示出一定的抗疲劳活性。人参水煎剂组、人参total RNA组、miR5072组、mi R5658组和mi R8175组小鼠SOD活力显著升高,MDA含量下降,腓肠肌Na~+K~+-ATP酶活性升高,血清IL-4水平显著升高,TNF-α水平降低,提示人参水煎剂及其部分miRNA可能通过改善能量代谢、抗氧化应激、调节机体免疫达到缓解疲劳的作用。3、将灌胃人参水煎剂的小鼠血液进行高通量测序,通过比对人参参考基因组,共鉴定出23个家族的30个人参miRNA。对得到的人参miRNA进行靶基因预测,得到2955个与免疫相关的靶基因。将靶基因进行GO和KEGG富集分析,发现靶基因富集在细胞过程(cellular process)、生物调节(biological regulation)、免疫系统过程(immune system process)等方面。这些结果从一定程度说明人参miRNA可能对小鼠的免疫功能有影响。这使得在理论上miRNA进行跨物种调控成为一种可能。4、利用RT-qPCR在小鼠血液、脾脏和胸腺检测到miR159,miR166和miR8175,表明部分人参miRNA可以通过口服进入小鼠组织器官。同时通过RT-q PCR验证,人参total RNA组小鼠体内的免疫基因表达量有明显变化,脾脏中IL4R表达量显著下降,提示人参miRNA对小鼠免疫基因有一定影响。结论:人参水煎剂及其部分miRNA可以通过改善能量代谢、抗氧化应激、调节机体免疫以缓解机体疲劳,提示人参miRNA可能作为一种药效物质参与了人参的补气抗疲劳作用,人参miRNA可能发挥跨界调控作用。通过高通量测序和RT-qPCR技术可以从人参水煎剂、灌胃人参水煎剂的小鼠血液、脾脏和胸腺中检测到部分人参miRNA的存在,表明人参miRNA可以通过胃肠道进入小鼠体内,人参mi RNA的抗疲劳作用存在跨界调控的物质基础,有利于今后进一步深入研究揭示跨界调控作用机制。