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在大多数鱼类中,17α,20β-双羟孕酮(DHP)和前列腺素F2α(PGF2α)在卵母细胞成熟和排卵过程中发挥了重要作用,其作用机理研究较为深入。近期的研究表明,这两种激素在诱发卵母细胞成熟和排卵的同时,也参与了雌鱼生殖行为的调控,然而其机理还未阐明。本课题组先前的研究表明,生殖季节大弹涂鱼(Boleophthalm us pectinirostris)呈现半月周期产卵节律,其血液中17α-OHP(DHP的前体)的水平,也呈现半月周期节律,且峰值与产卵期重合。依据近期的研究进展,我们推测性成熟雌性大弹涂鱼在卵母细胞成熟和排卵过程中,卵巢所合成的DHP和PGF2α,有可能反馈作用于脑组织,诱发雌鱼的生殖行为。基于这一假设,本论文以DHP和PGF2α的受体——Pgr和Ptgfr为研究对象,应用分子生物学技术,克隆获得了大弹涂鱼Pgr和Ptgfr的cDNA序列,并研究了pgr和ptgfr在雌鱼体内的组织分布模式,以及生殖季节ptgfr在脑组织中的半月周期表达趋势,并进一步探究了DHP对大弹涂鱼脑组织中pgr和ptgfr的调控。主要研究结果如下:1、大弹涂鱼pgr的克隆、功能性状分析和组织表达研究:克隆获得的大弹涂鱼pgr的CDS全长为1968 bp,编码一个长度为655个氨基酸的蛋白。系统进化树分析显示,大弹涂鱼的Pgr和其鱼类的Pgr形成一个分支,独立于其他物种如哺乳类、鸟类、爬行类和两栖类的PGRs。荧光实时定量PCR(qPCR)分析结果显示,pgr在雌性大弹涂鱼的许多组织中均有表达。在外周组织中,pgr在卵巢中表达量最高;在脑组织中,pgr表达量在垂体中最高,其次为间脑。为了验证大弹涂鱼Pgr的功能性状,利用pcDNA3.1+表达载体构建大弹涂鱼pgr基因的表达质粒,并与包含pGL3-MMTV-Lu质粒启动子的表达质粒共同导入HEK293T细胞种进行表达。结果显示,在激素DHP、P4、17α-OHP作用下大弹涂鱼Pgr能够转录激活MMTV启动子,且存在明显的浓度依存效应,其中DHP的半最大效应浓度(EC50)最低。2、大弹涂鱼ptgfr的组织表达研究根据已经公布的大弹涂鱼ptgfr的基因序列,应用qPCR技术,检测到ptgfr在雌性大弹涂鱼的许多组织中均有表达。在外周组织中,ptgfr在皮肤中的表达量最高;在脑组织中,ptgfr的表达水平在延髓中最高,其次在间脑。在生殖季节的一个完整月相周期中(2015年5月19日至6月18日),间隔3天采集雌性大弹涂鱼(体长11.1-14.1 cm,体质量17.1-21.7 g)脑组织,qPCR结果显示ptgfr的表达水平呈现接近半月周期的节律现象。3、DHP对大弹涂鱼间脑中pgr、ptgfr和垂体中fshb、lhb、pgr的表达研究(1)于2017年6月、9月,201 8年1月、4月、6月采集雌性大弹涂鱼成鱼(体长9.2-13.0 cm,体质量为18.0-24.1 g),活体注射DHP(50 μg/尾)6h后取样分析。qPCR结果显示,在6月和9月,DHP可显著促进间脑中ptgfr表达量,但对pgr的表达量无显著影响。在1月份和4月份,DHP对ptgfr和pgr的表达量未有显著影响。(2)在生殖季节(2018年4-6月),采集性成熟雌性大弹涂鱼(体长9.5-13.0 cm,体质量为18.1-25.9 g),活体注射DHP(50μg/尾)6h后取样,qPCR结果显示,垂体fshb、lhb、pgr的表达量与对照组对比均未有显著上升。(3)于2018年7月13日采集雌性大弹涂鱼(11.0-13.1 cm,体质量为22.1-27.8 g),解剖获得雌性大弹涂鱼间脑组织,并进行体外培养实验。qPCR结果显示,100 nM DHP暴露3 h后,雌性大弹涂鱼间脑中ptgfr和pgr的表达量都有显著提高。综上所述,本研究明确了DHP是大弹涂鱼Pgr的最适配体;pgr和ptgfr在大弹涂鱼脑组织中的间脑部分表达量较高。在生殖季节,ptgfr在性成熟雌鱼间脑中呈现类似半月周期的表达趋势。进一步研究观察到,仅在生殖季节,活体注射DHP可显著促进间脑中ptgfr的表达量;离体条件下,DHP可显著促进间脑中pgr和ptgfr的表达量。这些结果提示,DHP可能是通过Pgr上调ptgfr基因的表达。