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氨肽酶是一类外切酶,其作用于多肽链或蛋白质的N-末端,在药物的合成、食品风味和营养的提升、蛋白序列的分析及固化剂应用等方面具有重要作用。目前,已有一些关于枯草芽孢杆菌来源的氨肽酶的研究,且不同来源的氨肽酶的性质有一定的差异。基于此,本研究合成了枯草芽孢杆菌BSP1(简称BSP1)来源的去除信号肽序列后的氨肽酶基因,并将此基因在酵母GS115中表达,探究其酶学性质。具体内容如下:1.目的基因的克隆及重组载体pHBM905A-ywaD的构建设计两条引物ywaD-F和ywaD-R,以BSP1的总DNA为模板,通过PCR将去除信号肽序列后的氨肽酶扩增下来,转入pHBM905A中。采用菌落PCR及测序来检测序列的正确性,鉴定正确后,将正确的重组载体命名为pHBM905A-ywaD。2.毕赤酵母的转化及重组子的筛选通过化学法,将SalI线性化后重组质粒转入GS115中。通过酵母菌落PCR初筛选出可能的重组子,再通过摇瓶发酵获得酵母上清,进行SDS-PAGE检测到氨肽酶是否表达。将重组毕赤酵母菌命名为GS115-pHBM905A-ywaD。3.重组氨肽酶YwaD的表达及诱导条件的优化将酵母重组子接种到BMGY中富集培养后,再转接到BMMY中,每隔24 h加1%甲醇持续诱导288小时,并收集重组氨肽酶YwaD。重组酵母GS115摇瓶诱导288 h达最大表达量734 mg/L。为探究诱导时的pH对氨肽酶表达的影响,重组酵母分别于不同pH的BMMY中培养。氨肽酶在诱导pH 4.0、5.0及有0.1 M的磷酸缓冲液的培养基中诱导时较稳定,且氨肽酶在诱导pH 5.0时达到最大表达量908 mg/1。为探究酵母细胞密度对氨肽酶表达的影响,将几乎相同生物量的重组酵母转接到不同体积(25 mL、50 mL、100 mL)的BMMY中,用1%的甲醇诱导培养,发现氨肽酶在三种细胞密度的培养基中均较稳定性,而在25 mL的BMMY中诱导时达到最高表达量1227 mg/L。4.氨肽酶的纯化及糖基化染色分析将氨肽酶进行超滤、Ni亲和层析及凝胶过滤层析这三步纯化,使得氨肽酶YwaD纯化倍数为5.19,最终得率为59.82%。SDS-PAGE发现氨肽酶的带约55 kDa,大于理论值47 kDa。经预测发现,氨肽酶存在潜在的糖基化位点(3个N-糖基化位点和2个O-糖基化位点)。对氨肽酶YwaD进行糖基化染色,发现重组氨肽酶在酵母GS115中表达时确实发生了糖基化修饰。5.氨肽酶的酶学性质的研究氨肽酶YwaD的最适pH为8.5,最适温度为40℃。氨肽酶在50℃以下及pH 6.5-9.0范围内较稳定。EDTA使YwaD完全失活,说明氨肽酶YwaD是金属依赖型酶。Co2+能剧烈激活此氨肽酶,而Cu2+(1mM)和Ni2+(1mM)对YwaD有强烈抑制作用。另外,DTT、β-巯基乙醇及SDS也对氨肽酶YwaD有抑制作用,而PMSF及尿素对氨肽酶几乎无明显的抑制作用。值得一提的是,尿素对氨肽酶YwaD有很强的耐受性,氨肽酶在10 M尿素中孵育30 min后仍有80%左右。最后,本实验发现,氨肽酶最适宜的底物为Arg-pNA。