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猪肉在我国居民肉类消费中占有很大的比例。猪脂肪沉积受到了一系列基因及非编码RNA(Micro RNA,Lnc RNA和Circ RNA)的调控,其中Micro RNA(miRNA)是一种长19-22个核苷酸(nt)的非编码RNA,通过结合靶基因3’UTR抑制靶基因翻译。大量的研究表明miRNAs可以参与调控猪皮下与肌内脂肪的沉积。通过分析猪皮下和肌内脂肪细胞miRNAs测序结果后,发现miR-324-5p在皮下和肌内脂肪细胞分化后表达量显著性增加,而且miR-324-5p种子序列在猪、大鼠、小鼠等物种间高度保守。脂滴除了可以沉积于脂肪细胞外也可以沉积肌细胞等非脂肪细胞,其中沉积于肌细胞的脂滴形成肌内脂肪。本实验室之前的研究发现油酸盐可以诱导肌细胞内脂肪的沉积。因此,本研究以猪皮下脂肪细胞,小鼠和C2C12成肌细胞为研究材料,旨在探究miR-324-5p对猪皮下脂肪细胞分化和C2C12成肌细胞沉积脂质积累的作用与调控机制。本实验通过对猪皮下脂肪细胞转染miR-324-5p模拟物(agomiR)和拮抗剂(antagomiR),研究了miR-324-5p对猪皮下脂肪细胞分化的作用;运用生物信息学分析预测了miR-324-5p的靶基因,并用双荧光素酶报告实验进行了验证;构建靶基因过表达载体研究其在脂肪细胞分化过程中发挥的作用及与miR-324-5p的靶向关系。对小鼠腹腔注射miR-324-5p agomiR,在活体水平验证miR-324-5p对小鼠脂肪沉积的作用。利用油酸盐诱导C2C12成肌细胞脂质积累,过表达或抑制miR-324-5p,探究miR-324-5p对肌细胞内脂质积累的作用及机制。获得以下主要结果:1.MiR-324-5p生物信息学分析通过比较miR-324-5p在不同物种间的成熟序列,发现miR-324-5p在物种之间高度保守;检测miR-324-5p在7日龄和180日龄关中黑猪不同组织中的表达情况,结果发现,miR-324-5p在不同日龄关中黑猪脂肪组织中均有较高的表达水平,而且miR-324-5p在猪皮下与肌内脂肪细胞分化后期表达量均升高。对miR-324-5p靶基因进行GO分析和KEGG分析发现,miR-324-5p与脂肪形成相关。2.过表达miR-324-5p促进猪皮下脂肪细胞分化油红O和Bodipy染色结果发现,过表达miR-324-5p可以增加脂滴积累;实时定量荧光PCR和蛋白免疫印迹发现,过表达miR-324-5p可以显著增加成脂相关基因PPARγ(P<0.05),ap2(P<0.05)和C/EBPα(P<0.05)m RNA和蛋白的表达水平。而抑制miR-324-5p表达则得到了相反的结果。3.MiR-324-5p可以靶定KLF3利用miRNA靶基因预测软件分析发现,KLF3可以作为miR-324-5p的一个候选靶基因;过表达miR-324-5p可以显著抑制KLF3 m RNA和蛋白的表达水平(P<0.05);而抑制miR-324-5p后则可以显著增加KLF3 m RNA表达(P<0.05);双荧光素酶报告实验结果发现,miR-324-5p可以显著抑制双荧光素酶的活性(P<0.05);过表达KLF3显著抑制脂肪细胞分化(P<0.05),而过表达KLF3的同时过表达miR-324-5p可以部分恢复KLF3对脂质积累和成脂分化相关基因的抑制作用。4.过表达miR-324-5p促进小鼠脂肪沉积对小鼠腹腔注射miR-324-5p agomiR,结果发现,过表达miR-324-5p能够显著增加小鼠体重(P<0.05)而不影响其采食量;体成分分析发现,过表达miR-324-5p可以显著增加皮下脂肪,内脏脂肪和棕色脂肪组织的重量(P<0.05)而不影响肝脏的重量;H&E染色结果发现,过表达miR-324-5p可以显著增加皮下脂肪组织和内脏脂肪组织中脂肪细胞的面积(P<0.05),而不影响肝脏脂肪沉积;实时定量荧光PCR和蛋白免疫印迹发现,过表达miR-324-5p可以显著增加脂肪组织中脂合成相关基因FASN和SREBP1c的表达水平(P<0.05),降低皮下脂肪组织和内脏脂肪组织脂解相关基因HSL和ATGL的表达水平(P<0.05),但不影响肝脏的成脂和脂解;另外,过表达miR-324-5p显著降低了脂肪组织和肝脏KLF3的表达水平。5.MiR-324-5p可以促进油酸盐诱导的成肌细胞内脂质积累Bodipy和油红O染色发现,过表达miR-324-5p可以促进油酸盐诱导的成肌细胞肌管内脂质积累,显著增加长链脂肪酸合成相关基因Evolv6(P<0.05)、GPAM(P<0.05)和DGAT2(P<0.05)表达,抑制ACC2(P<0.05)的表达;而抑制miR-324-5p则得到了相反的结果。6.MiR-324-5p可以提高油酸盐诱导的C2C12成肌细胞内线粒体功能油红O和Mito-Tracker染色发现,过表达miR-324-5p可以增加脂滴和线粒体数目,显著增加线粒体拷贝数(P<0.05);过表达miR-324-5p可以显著增加线粒体代谢和脂肪酸β氧化相关基因Tfam、Cox7a、CPT1、CD36和Acadm的表达水平(P<0.05);抑制miR-324-5p则得到了相反的结果。以上结果表明,miR-324-5p通过促进线粒体功能促进C2C12脂质积累。总之,本研究在细胞和个体水平发现miR-324-5p可以通过靶定KLF3促进脂肪细胞分化和脂肪沉积,也可以通过增强线粒体功能促进油酸盐诱导的C2C12成肌细胞脂质积累。这一结论不仅表明miR-324-5p对脂肪沉积发挥了重要的作用,而且为进一步探究家畜尤其是猪脂肪沉积的分子机理提供了理论依据。