【摘 要】
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目的:探讨洛伐他汀（Lovastatin,LV）对三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer,TNBC）细胞糖酵解的作用及分子机制。方法:1、LV对TNBC细胞代谢的影响:用LV处理TNBC细胞MDA-MB-231后,利用核磁共振氢谱（1H-NMR）技术检测细胞中的代谢物,并用偏最小二乘回归分析法（PLS-DA）分析代谢物VIP（Variable Importance
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目的:探讨洛伐他汀（Lovastatin,LV）对三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer,TNBC）细胞糖酵解的作用及分子机制。方法:1、LV对TNBC细胞代谢的影响:用LV处理TNBC细胞MDA-MB-231后,利用核磁共振氢谱（1H-NMR）技术检测细胞中的代谢物,并用偏最小二乘回归分析法（PLS-DA）分析代谢物VIP（Variable Importance in Projection）。接着,LV处理MDA-MB-231细胞后,用Seahorse能量代谢监测仪检测细胞外酸化率（Extracellular acidification rate,ECAR）,反映基本糖酵解（Glycolysis）、最大糖酵解能力（Glycolytic capacity）和糖酵解储备（Glycolytic reserve）。用Western blot检测糖酵解相关蛋白（Glucose transporter 1,GLUT1;Hexokinase2,HK2;6-phosphofructokinase subunit alpha,PFK1;Pyruvate kinase M2,PKM2）的蛋白水平。2、LV对HK2与VDAC的影响:用LV处理TNBC（MDA-MB-231）和非TNBC（MDA-MB-453）细胞后,通过免疫荧光-激光共聚焦显微镜技术观察TNBC中HK2与VDAC的共定位,用免疫共沉淀技术（Co-IP）检测HK2与VDAC蛋白的相互作用。3、LV对TNBC细胞自噬的影响:用LV处理TNBC和非TNBC细胞后,免疫荧光-激光共聚焦显微镜观察TNBC细胞LC3的斑点状信号,用Western blot检测自噬相关蛋白（LC3,m TOR,Akt和AMPK）的总蛋白或磷酸化蛋白水平。通过免疫组织化学技术（IHC）检测自噬通路相关蛋白（Akt和AMPK）的磷酸化水平。4、HK2与VDAC表达与乳腺癌预后的关系:通过Kaplan-Meier plotter数据库（http://kmplot.com/analysis/）分析HK2与VDAC的表达与乳腺癌患者生存的关系。结果:1、LV能明显抑制TNBC细胞糖代谢作用:相比于对照组,1H-NMR技术显示,LV处理后,在MDA-MB-231细胞中共获得46种代谢物,PLS-DA分析的VIP图结果显示乳酸的VIP值最大。海马实验检测发现LV能明显减少MDA-MB-231细胞的基础糖酵解、最大糖酵解能力和糖酵解储备,并且随LV浓度增加抑制作用更明显。Western blot结果显示LV能明显下调MDA-MB-231细胞中GLUT1,PFK1,PKM2的蛋白水平,而对于MDA-MB-453细胞,这些蛋白水平没有明显变化。2、LV明显下调HK2与VDAC的相互作用:免疫荧光-激光共聚焦结果发现,在MDA-MB-231细胞中,LV能明显减少HK2与VDAC的共定位;同时Co-IP结果发现LV能够降低HK2与VDAC蛋白的相互作用。3、LV能诱导TNBC细胞发生自噬:免疫荧光-激光共聚焦结果显示,LV能明显增加MDA-MB-231细胞中LC3的斑点状信号,在对照组MDA-MB-453细胞中这种变化并不明显。同时,Western blot结果显示,LV能明显增加LC3-II/I蛋白比值,且p-m TORSer2448,p-AktSer473水平明显下调,p-AMPKThr172水平明显上调,而MDA-MB-453细胞的LC3-II/I蛋白比值及自噬通路相关蛋白水平变化并不明显。进一步免疫组化结果显示,LV能明显下调p-AktSer473水平,上调p-AMPKThr172水平。4、HK2和VDAC表达与乳腺癌患者预后相关:通过生物信息学网站分析显示,HK2表达与乳腺癌患者总体生存时间呈正相关,VDAC表达与乳腺癌患者总体生存时间呈负相关。结论:LV可能通过调控糖酵解关键酶HK2与线粒体外膜蛋白VDAC的相互作用抑制TNBC细胞的糖酵解并且促进细胞自噬。
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