背景:人肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)感染可以引起儿童重症手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD),并伴有神经系统并发症。在过去的几十年里,EV71引发了大规模甚至重型HFMD的暴发流行。然而,在EV71分子流行病学研究中,以VP4基因分析为基础的基因型分类是否与基于VP1的基因分型保持一致尚不明确,也尚未有较全面的研究比对分析基于这两种基因的分型。而且,有关EV71VP4基因的分子进化信息尚知之甚少。此外,有关EV71的谱系地理学分析的研究亦不清楚。因此,挖掘近几十年、全球范围内EV71病毒株的VP4基因的生物学信息,对EV71的分子进化及谱系地理学研究具有重要意义,也为监测、预防和控制EV71感染所致HFMD流行提供一种新的策略与措施。目前,临床上尚未有治疗EV71感染所致HFMD的特效药。MicroRNA(miRNA)作为一种核酸类药物对疾病进行基因治疗具有潜在价值。在EV71与宿主互作的过程中,这种病毒可为了自身复制而破坏宿主的装置。MiRNA hsa-let-7c-5p在调控宿主通路介导的病毒与宿主互作中的作用机制尚不清楚。而且,hsa-let-7c-5p在EV71复制中的调控作用也尚未报道。由此,研究hsa-let-7c-5p介导的EV71与宿主互作有助于了解该病毒的致病机理,并为将来治疗疾病提供新的靶点。目的:(1)研究基于VP4基因的系统发育学分类,并深入探讨EV71的分子进化和谱系地理学;(2)研究miRNAhsa-let-7c-5p通过调控病毒破坏的丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶 4/c-Jun 氨基末端激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 4/c-Jun NH2-terminal kinase,MAP4K4/JNK)信号通路轴促进EV71复制的机制,并初探JNK信号通路通过自噬影响EV71复制的机制。方法:(1)在MEGA 5软件中利用邻接法构建系统进化树对EV71进行基因分型,并利用DNAstar-MegAlign程序分析基因型内和基因型间VP4核苷酸序列的差异性及其推演氨基酸序列的相似性;在BEAST2软件中利用基于VP4基因的贝叶斯系统发育学方法推测EV71种群的分化时间与进化速率;利用DnaSP软件对EV71种群的VP4基因进行多态性分析;在Hy-Phy软件包中的Datamonkey在线版中利用四种不同的以密码子为基础的最大似然法检测VP4基因在氨基酸水平所受的选择压力;在BEAST2软件中利用基于溯祖理论的BSP方法分析基因组B和C病毒的种群动力学。(2)利用leaflet程序对EV71各基因型的时空分布进行展示;在BEAST 2软件中利用离散型谱系地理学模型对EV71基因组B和C进行谱系地理学研究,推测出这两个基因组病毒的发源地及潜在的传播途径。(3)在EV71与宿主横纹肌肉瘤(rabdomyosarcoma,RD)细胞互作中,利用stem-loop qRT-PCR 检测 EV71 感染后 miRNA hsa-let-7c-5p 的表达变化;利用空斑实验、qRT-PCR、Western blotting 及 MTT 实验检测 hsa-let-7c-5p mimic、hsa-let-7c-5p抑制剂及MAP4K4敲低对EV71复制的影响;利用Luciferase 实验、qRT-PCR及 Western blotting 检测 hsa-let-7c-5p 对 MAP4K4的靶向调控;利用Western blotting检测MAP4K4的沉默表达、hsa-let-7c-5p mimic及其抑制剂对JNK与NF-κB信号通路的影响;利用空斑实验、qRT-PCR或Western blotting检测EV71与紫外灭活病毒感染对JNK信号通路的影响及JNK抑制剂SP600125对病毒复制的作用。(4)利用Western blotting检测EV71与紫外灭活病毒感染对自噬相关蛋白LC3与P62表达的影响;利用Western blotting或qRT-PCR实验检测SP600125对LC3与P62表达的影响;利用Western blotting检测自噬抑制剂氯喹处理RD细胞后,EV71感染对自噬溶酶体形成及氯喹对病毒结构蛋白VP1表达的影响。结果:(1)EV71的基因型可由VP4基因划分为3个基因组(A、B和C)和11个基因型(A,B1-B5和C1-C5),其中基因型C4又划分为3个基因亚型(C4al,C4a2和C4b),且基于VP4系统发育学的基因分型与基于VP1系统发育学的基因分型基本保持一致;EV71最早起源于20世纪中期,病毒基因组C的进化速率略高于基因组B,且这两个基因组中各基因型的分化时间比它们首次检测到的时间早1-7年;VP4基因的分子进化遵循中性模型,且VP4编码序列受较强的净化选择,并尚未发现受正向选择压力影响的氨基酸位点;推演的VP4氨基酸序列同源性高达91.3-100%;基因组B的VP4基因遗传多样性波动不明显于基因组C,且该基因遗传多样性的改变与EV71感染相关的HFMD的暴发或流行时间相对应。(2)EV71主要流行于北美、欧洲及亚太地区;EV71基因组B和C具有高确定性的地理起源分别是发生于1964.4-1965.2年的荷兰和1977.6-1981.4年的日本;病毒基因组B流行的12个地理位置和病毒基因组C流行的14个地理位置中分别共有9和13个统计学支持的流行病学纽带。(3)在RD细胞中,EV71感染上调成熟hsa-let-7c-5p的表达;hsa-let-7c-5p mimic促进这种病毒的复制,而其抑制剂能够抑制病毒的复制;hsa-let-7c-5p通过靶向MAP4K4抑制其表达;下调MAP4K4的表达导致EV71复制的增加;MAP4K4的敲低和hsa-let-7c-5p mimic的转染激活JNK信号通路,而hsa-let-7c-5p抑制剂能够抑制这条信号通路的激活;EV71诱导的JNK信号通路的激活进一步有利于病毒的复制。(4)EV71的复制可以诱导RD细胞的自噬;JNK信号通路的阻断能够抑制EV71诱导的自噬;氯喹可以阻断EV71诱导的自噬溶酶体的形成,并抑制病毒的复制。结论:(1)VP4基因可以应用于EV71的基因分型,并可作为EV71流行的分子监测因子和潜在的抗病毒药物靶点。另外,EV71流行的北美、欧洲及亚太地区之间存在潜在的区域内或区域间的病毒传播途径。(2)EV71感染上调的hsa-let-7c-5p可以通过抑制MAP4K4的表达促进病毒的复制,这一过程与病毒破坏的MAP4K4/JNK信号通路轴有关。另外,JNK信号通路可通过诱导自噬促进EV71复制。