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第三代重组免疫毒素是靶向治疗癌细胞的一个热点。与传统放疗和化疗方法相比,免疫毒素对癌细胞具有靶向专一性和高效凋亡毒性,具有广阔应用前景。20世纪70年代末,白喉毒素因被发现对动物细胞具有很强的诱导细胞凋亡活性而被深入研究。经过30多年发展,白喉毒素诱导动物细胞凋亡机制和空间构象已被探究清晰,并被广泛应用于重组免疫毒素的制备。本课题藉由基因工程技术将白喉毒素N端389个氨基酸(DAB389)和靶向人表皮生长因子受体-2(HER2/neu)抗体单链可变片段(4D5 scFv)通过柔性链接(G4S)3连接,构建重组免疫毒素DAB389-4D5 scFv。由于目的蛋白DAB389-4D5 scFv在大肠杆菌宿主BL21(DE3)中表达水平很低,通过对DAB389基因翻译起始序列(TIR)进行了同义密码子优化,将TIR mRNA最小折叠自由能△G从-16.4提高到-8.4 kcal/mol,使DAB389-4D5 scFv占上清可溶蛋白的表达水平从低于5%提高到36.7%。经过疏水作用和离子交换层析,目的蛋白纯度达到98%,得率达到30 mg/L。经MTT实验结果计算,DAB389和DAB389-4D5 scFv对HER2/neu过表达卵巢癌细胞SK-OV-3的IC50值分别为15 nM和0.37 nM,表明4D5 scFv对HER2高表达的SK-OV-3细胞具有较好的靶向选择性。而且,当DAB389-4D5 scFv的浓度低于5 nM,其对HER2阴性的人胚胎肾正常细胞HEK-293没有增殖抑制作用。激光共聚焦免疫荧光分析结果表明DAB389-4D5 scFv对SK-OV-3靶向结合,而对HEK-293细胞无选择性,证明了4D5 scFv与HER2结合极大地提高了DAB389进入细胞的效率。流式细胞实验结果表明DAB389-4D5 scFv能强烈诱导SK-OV-3细胞的凋亡和坏死,而对HEK-293无明显增殖抑制作用。总之,本课题为治疗HER2阳性癌细胞提供了一种新的选择。为进一步提高DAB389对肿瘤细胞的靶向性,本课题将DAB389与两个4D5 scFv融合,构建重组免疫毒素DAB389-4D5 scFv-4D5 scFv,其对SK-OV-3的IC50值为0.35 nM,证明了一个4D5 scFv已足够提高DAB389靶向结合效率。将癌细胞靶向穿膜肽BR2融合到4D5 scFv的C端,构建DAB389-4D5 scFv-BR2,其对SK-OV-3的IC50值为0.13 nM,其毒性与DAB389-4D5 scFv相比提高3倍。为了实现免疫毒素活性的光学调控,将光控剪切内含肽InN-LOV2-InC插入到DAB389-4D5 scFv特定位点,并对其光控自我剪接发挥抗肿瘤活性进行了初步探究。