第一部分TGF-β2　刺激人Tenon囊成纤维细胞增殖,表达结缔组织生长因子和合成纤维连接蛋白目的:本实验通过研究体外培养的人Tenon囊成纤维细胞(HTF)在转化生长因子(TGF-β2)刺激下是否发生增殖,表达结缔组织生长因子(CTGF)和合成纤维连接蛋白(Fn)。方法:将从临床上取的人眼球筋膜组织剪碎后进行体外贴壁细胞常规培养,取第三到五代细胞做实验。(1)SP法染色鉴定Tenon’s囊成纤维细胞;(2)在HTF中加入不同浓度的TGF-β2(0,0.5,1, 2, 4,5,10ng/ml),诱导培养24h后,用噻唑蓝比色法( MTT法)检测不同浓度的TGF-β2对细胞增殖的刺激作用;(3)在MTT法结果基础上选择TGF-β2(0,2,4,5 ng/ml)四个不同的浓度分别作用HTF,然后用RT-PCR和免疫细胞化学法分别检测四组中CTGF和Fn的表达。结果:TGF-β2 2ug/l到5ug/l范围有剂量依赖性地促进HTF的细胞增殖,CTGF的表达和Fn的合成的趋势(P <0.01),但0.5ug/l,1ug/l与正常对照组对细胞的增殖作用差别无显著性,5ug/l与10ug/l对细胞的增殖作用也无显著性差异(P>0.05)。结论:TGF-β2能够明显地促进HTF细胞增殖,并增强其下游介质(CTGF)的表达和合成细胞外基质-Fn。第二部分反义寡核苷酸对人Tenon囊成纤维细胞结缔组织生长因子表达和纤维连接蛋白合成的抑制作用目的:由实验第一部分可知TGF-β2能够刺激HTF发生增殖,表达结缔组织生长因子和合成纤维连接蛋白,那么用其下游作用介质(CTGF)的反义寡核苷酸(ASODN)作用同时经TGF-β2刺激的HTF看其是否能够抑制TGF-β2的以上作用。方法:(1)用MTT法检测不同浓度(2.5,5,10ul/ml)脂质体(DOTAP)对人Tenon囊成纤维细胞(HTF)活性的影响;(2)用DOTAP分别包裹CTGF的反义和正义寡核苷酸制备DOTAP-AS和DOTAP-正义寡核苷酸复合物;(3)实验分为五个组:N组:空白对照组(仅加入无血清DMEM培养液); T: TGF-β2刺激组;A:反义寡核苷酸治疗组(TGF-β2+ DOTAP-AS);S:正义寡核苷酸对照组(TGF-β2 +DOTAP-正义寡核苷酸);D:无寡核苷酸对照组(TGF-β2+DOTAP)。其中TGF-β2的浓度均为5 ng/ml,DOTAP和ASODN的终浓度分别为5ul/ml, 1.6ug/ml;(4)在以上分组的基础上,用RT-PCR和免疫细胞化学法检测Fn的合成,用RT-PCR和Western blot法检测CTGF的表达。结果:DOTAP的三个浓度组作用HTF后的OD值与正常对照组无显著性差异;转染12h后CTGF和Fn mRNA水平A组的相对灰度RI值明显高于T组(P<0.01),与N组差异无统计学意义,而S组和D组与T组差异无统计学意义;CTGF和FN的蛋白水平与mRNA水平的表达相一致。结论:CTGF的ASODN能够在一定程度上抑制TGF-β2对HTF表达CTGF和合成纤维连接蛋白(Fn)的刺激作用。