CD86(又称B7-2)基因定位于人的染色体3q21.1位点,总长度为1120bp,分子量约为50KD。该分子主要为表达于抗原提呈细胞(Antigen presenting cell,APC)包括巨噬细胞、树突状细胞及B淋巴细胞等表面的跨膜糖蛋白。在正常生理状态下,其作为配基分子与T细胞表面的受体CD28分子相结合,介导T细胞活化的第二信号,促进T细胞的活化、增殖及发挥免疫应答作用。随着研究的深入,发现CD86分子在诸多肿瘤上也异常高表达,且己证实其参与了肿瘤的发生发展及预后过程。目前,己有研究表明,通过特异性抗体封闭肿瘤细胞表面的CD86分子,可诱导细胞发生凋亡,具有明显的抑瘤作用。为深入探究CD86分子在肿瘤细胞上表达的生物学意义,可在基因水平上,通过上调或下调该分子的表达,来研究其在细胞中所发挥的主要功能及作用,以此寻找用于肿瘤治疗的新的靶点分子。鉴此,本文旨在进行以下研究:①、运用本科室自行构建的能稳定表达目的分子的基因转染细胞株L929-CD86为免疫原,采用B淋巴细胞杂交瘤技术制备能稳定分泌鼠抗人CD86单克隆抗体的杂交瘤细胞株。生产腹水型抗体,应用Protein A亲和免疫层析法纯化该抗体,并对抗体的亚类、效价及特异性进行鉴定。②、运用自行制备的单克隆抗体与高表达CD86分子的肿瘤细胞进行共同孵育,体外观察其对肿瘤细胞生长、增殖、迁移及凋亡的影响。③、在上述研究的基础之上,又采用RNAi技术下调肿瘤细胞表面CD86分子的表达,再行观察该分子对肿瘤细胞增殖及迁移的影响,并与上述研究进行比较,探究CD86分子在相关肿瘤的发生发展过程中可能发挥的作用。共同寻找具有抑瘤作用的新的靶向分子。第一部分鼠抗人CD86单克隆抗体的制备及生物学特性的鉴定目的:制备鼠抗人CD86单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法:利用本室自行构建的能稳定表达目的分子的基因转染细胞株L929-CD86为免疫原,免疫BALB/c小鼠。采用B淋巴细胞杂交瘤技术制备融合细胞。经免疫荧光标记法及连续亚克隆筛选能稳定分泌目的抗体的杂交瘤细胞。运用抗体亚类快速定性试纸条及Elisa试剂盒测定抗体的亚类。杂交瘤细胞经扩大化培养后,采用裸鼠体内诱生腹水法制备腹水型抗体,并经Protein A亲和免疫层析法进行纯化。通过流式细胞术(FCM)对纯化抗体的效价进行检测。FCM分析该抗体与抗人CD86商品化抗体的位点竞争抑制结合情况。应用免疫荧光标记法检测抗体对 L929-mock、L929-CD86、Raji、Daudi、8266、Jeko、U266、DOHH2、HCT116、A375、7721、TMD8、U937、A549、HepG-2 及 MCF-7 细胞表面膜型分子的识别作用。结果:经上述方法进行细胞融合,共融合24块96孔细胞培养板,融合率为70%。经免疫荧光标记法及连续亚克隆成功筛选出1株能稳定分泌CD86抗体的杂交瘤细胞株,命名为12G4。亚类快速鉴定试纸条及试剂盒鉴定结果一致,12G4的重链为IgG2b,轻链为K。经裸鼠体内诱生腹水法制备单克隆抗体,腹水形成率为100%,平均收货量4ml/只。腹水型抗体经纯化后得到抗体蛋白的得率为1.61 mg/ml。纯化抗体的效价为0.1 μg/5×105个细胞。位点竞争抑制实验表明,12G4与抗人CD86商品化抗体(TT2.2)可识别不同的抗原表位。本实验获得的鼠抗人CD86 mAb能很好的识别细胞膜型分子,其与L929-mock、L929-CD86、Raji、Daudi、8266、Jeko、U266、DOHH2、HCT116、A375、7721、TMD8、U937、A549、HepG-2 及 MCF-7 细胞的阳性结合率依次为 0.51%、100%、96.5%、99.0%、99.8%、33.6%、25.2%、15.7%、2.87%、1.37%、1.00%、1.76%、3.69%、1.07%、1.97%及 1.76%。结论:成功制备了鼠抗人CD86单克隆抗体,为后续研究提供了物质基础。第二部分抗体封闭CD86分子对肿瘤细胞生长及迁移的影响目的:运用自行制备的单克隆抗体封闭肿瘤细胞表面的CD86分子,体外观察抗体对细胞增殖、迁移及凋亡的影响。方法:以天然高表达CD86分子的Raji、Daudi及8266细胞株为观察对象,加入终浓度分别为5 μg/ml、10 μg/ml及20 μg/ml的CD86 mAb共同孵育。培养至24h时,采用FCM检测抗体对细胞凋亡的诱导作用。共同孵育至48h时,运用MTT检测抗体对细胞增殖的影响,同时通过TranswellTM研究抗体对细胞迁移的影响。结果:Raji、Daudi及8266细胞与抗体共同孵育24h,显微镜下进行观察,相比于同型对照组,抗体组细胞抱团情况严重、折光性及立体感均下降。MTT结果显示,共同培养至48h,20 μg/ml抗体对细胞的增殖己可产生明显的抑制作用(P<0.05),增殖的抑制率依次为23±1.28%、25±1.48%、20±2.25%。FCM结果显示,当抗体浓度为20 μg/ml时,Raji、Daudi及8266细胞的凋亡率分别为16±1.15%、18±1.53%及14±2.52%,均明显高于同型对照组(P<0.05)。TranswellTM结果显示,共培养48h时,20 μg/ml抗体组的Raji、Daudi和8266细胞的迁移率分别为26±0.25%、23±2.08%和24±1.52%,与同型对照组细胞的迁移率依次为36±2.52%、33±0.58%和34±0.76%相比,均明显低于同型对照组(P<0.05)。结论:本研究自行制备的单抗对表达CD86分子的肿瘤细胞的增殖及迁移具有抑制作用,同时可诱导其发生凋亡。提示该抗体对表达相应抗原分子的肿瘤具有一定的抗瘤效应。第三部分RNAi抑制CD86分子的表达对肿瘤细胞增殖及迁移的影响目的:通过RNAi技术下调肿瘤细胞表面CD86分子的表达,探讨该分子在细胞增殖及迁移过程中可能发挥的作用。方法:从GenBank中查询人CD86 mRNA的编码序列,设计并合成siRNA的模板DNA序列,将其导入到转移载体PGLV3(H1/GFP)中。通过脂质体法将转移载体 PGLV3(H1/GFP)、包装辅助质粒 PG(Gag/Pol)、PG(Rev)及包膜质粒 PG(VSV-G)共转染至293T细胞中,包装产生重组慢病毒,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,经浓缩得到用于感染目的细胞的病毒液。将病毒原液以十倍稀释3个梯度分别感染对数生长期的293T细胞,应用荧光显微镜对重组慢病毒原液的滴度进行测定。用1×108 TU/mL、1×107 TU/mL及1×106 TU/mL的病毒稀释液分别感染对数生长期的Raji、Daudi及8266细胞,采用FCM及免疫印迹法(Western blot)检测慢病毒对细胞的感染效率及对细胞表面CD86分子表达的干扰效应。并通过MTT及TranswellTM分别检测慢病毒介导RNAi下调CD86分子对肿瘤细胞增殖及迁移的影响。结果:在人CD86分子的CDS区中选择了 3个RNAi的靶位点,序列设计后,由GenePharma公司合成了转录shRNA模板的oligo序列,并成功制备了重组人CD86 shRNA慢病毒表达载体,依次命名为LV3-142、LV3-406及LV3-644,其滴度分别为 1×109 TU/mL、2×109 TU/mL 及 1×109 TU/mL。FCM 分析表明,随着病毒稀释液浓度的增加,细胞中绿色荧光蛋白的表达量也逐渐增加,感染的最佳浓度为1 ×108 TU/mL。其中对上述细胞感染效果最好的重组慢病毒为LV3-142,感染效率依次为86±3.93%、88±1.64%及88±2.87%。同时经三个不同序列的重组慢病毒感染后,细胞表面CD86分子的mean值均明显降低,其中LV3-142的干扰效果最为明显,上述细胞表面的CD86 mean值依次降低了 67±3.99%、41±2.59%及48±4.78%(P<0.001)。Western Blot结果也证明,干扰效果最好的为LV3-142,其对Raji、Daudi及8266细胞中CD86分子的干扰效率依次为58±1.05%、41±3.55%及 42±0.42%(P<0.001)。MTT 结果表明,经 LV3-142 感染后,Raji、Daudi 及 8266细胞的增殖均受到明显抑制(P<0.05),其增殖的抑制率依次为24±2.13%、18±1.59%及 15±1.76%。TranswellTM 结果显示,经 LV3-142 感染后,Raji、Daudi 及 8266 细胞的迁移率依次为28±2.04%、30±0.85%及28±0.17%,均低于LV3-NC对照组(35±1.89%、36±1.63%及 33±1.92%),差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:重组人CD86 shRNA慢病毒通过干扰肿瘤细胞表面CD86分子的表达,可抑制其增殖及迁移。进一步提示肿瘤细胞表面的CD86分子可能参与了肿瘤的发生发展及预后过程。