【摘 要】
：
目的:肿瘤细胞与正常细胞有不同的能量代谢表型,其多利用糖酵解产生能量[1],因此糖代谢相关的糖酵解酶与肿瘤的关系即成为关注的焦点。3-磷酸甘油醛-脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）是我们在临床样本中用2D-DIGE结合质谱技术筛选出的肿瘤组织与癌旁组织的差异蛋白,前期研究发现GAPDH敲低的稳转细胞增殖能力减弱,且细胞迁移和侵袭能
论文部分内容阅读
目的:肿瘤细胞与正常细胞有不同的能量代谢表型,其多利用糖酵解产生能量[1],因此糖代谢相关的糖酵解酶与肿瘤的关系即成为关注的焦点。3-磷酸甘油醛-脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）是我们在临床样本中用2D-DIGE结合质谱技术筛选出的肿瘤组织与癌旁组织的差异蛋白,前期研究发现GAPDH敲低的稳转细胞增殖能力减弱,且细胞迁移和侵袭能力显著降低[2]。肿瘤的发生、发展是一个由多种信号网络调控的复杂过程,线粒体可能是这个网络的衔接中心。它起着平衡肿瘤细胞内包括促凋亡与抗凋亡、糖酵解与氧化磷酸化等在内的各种代谢过程。线粒体结构的完整性对细胞生存及能量代谢的进行至关重要,线粒体相关蛋白和细胞色素C的变化是反映线粒体结构被破坏的标志。而与线粒体膜密切相关的Bcl-2家族蛋白作为凋亡的经典蛋白又是判断细胞凋亡的重要指标。因此,本实验预研究GAPDH敲降是否通过干预线粒体进而影响人肺鳞癌细胞NCI-H520凋亡,期望打破GAPDH作为“看家基因”的固有思想[3,4],探究GAPDH除糖酵解以外的新功能。方法:1.本实验室前期通过细胞转染的方法,将shRNA-NC和shRNA-GAPDH质粒载体分别转染到人肺鳞癌细胞NCI-H520中,成功构建了稳定转染阴性对照组NCI-H520-shRNA-NC 细胞、GAPDH 稳定敲低组 NCI-H520-shRNA-GAPDH6和NCI-H520-shRNA-GAPDH24细胞,分别取对数生长期的四种细胞株,检测GAPDH的表达情况,验证敲降效率。2.荧光检测四种细胞株中ATP的相对含量。3.通过顺铂（CDDP）构建细胞凋亡模型,用流式细胞术（flow cytometry analysis,FCM）、DAPI染色、透射电子显微镜技术对NCI-H520、NCI-H520-shRNA-NC、NCI-H520-shRNA-GAPDH6 和 NCI-H520-shRNA-GAPDH24 四种细胞株的凋亡情况进行检测。4.利用Western bloting方法检测顺铂诱导凋亡后,四种细胞株相关凋亡蛋白如Caspase-3、PARP以及Bcl-2家族中Bcl-xL、Bcl-2、Bax蛋白的表达情况。5.免疫荧光检测细胞色素C在胞质的含量变化。6.利用Western bloting方法检测顺铂诱导细胞凋亡后自噬蛋白Beclin 1的表达情况。结果:1.荧光检测结果显示,四种细胞株中ATP的含量没有显著差异。2.在顺铂诱导凋亡后,流式细胞术和DAPI染色结果显示,NCI-H520-shRNA-GAPDH6和NCI-H520-shRNA-GAPDH24细胞株的凋亡率与对照组NCI-H520-shRNA-NC相比显著增加（*p<0.05）,NCI-H520-shRNA-NC与野生型相比则无显著差异。透射电子显微镜观察到凋亡细胞的形态:凋亡细胞变小,微绒毛消失,细胞核碎裂,质膜出泡,同时还观察到了大量的自噬小体。3.NCI-H520-shRNA-GAPDH6和NCI-H520-shRNA-GAPDH24 细胞株与对照组 NCI-H520-shRNA-NC 相比 Cleaved-Caspase-3 和 Cleaved-PARP 显著增加（*p<0.05）;Bcl-xL、Bcl-2 蛋白表达显著减少（*p<0.05）,Bax蛋白表达显著增加（*p<0.05）,Bcl-2/Bax的比值降低了 6倍。4.在顺铂诱导凋亡后,免疫荧光结果显示:NCI-H520-shRNA-GAPDH6和NCI-H520-shRNA-GAPDH24细胞株胞质中细胞色素C的含量与对照组NCI-H520-shRNA-NC 相比显著增加（*p<0.05）,NCI-H520-shRNA-NC 与野生型相比则无显著差异。5.NCI-H520-shRNA-GAPDH6 和 NCI-H520-shRNA-GAPDH24 细胞株中自噬蛋白Beclin 1的表达与阴性对照组细胞相比显著增加（*p<0.05）。结论:1.GAPDH敲降不影响四种细胞株中ATP的含量。2.GAPDH敲降促进了顺铂诱导的人肺鳞癌细胞NCI-H520的细胞凋亡。3.GAPDH敲降促进了Caspase-3的活化,抑制了 PARP活性,促进了 Bax的表达,抑制了 Bcl-xL、Bcl-2的表达。4.GAPDH敲降促进了细胞色素C从线粒体释放到胞质中。
其他文献
1.目的:本文主要研究观察临床实践中早期乳腺癌患者抗肿瘤治疗相关心脏毒性并发症的发生率,评估潜在影响心脏毒性发生的危险因素。2.方法:2.1收集2010年1月至2014年1月于大连医科大学附属第一医院接受手术治疗确诊为早期浸润性乳腺癌的患者。全部患者接受新辅助治疗或者辅助治疗,具备完整的临床病理资料。2.2排除标准:1.既往确诊为乳腺癌或其他恶性肿瘤接受过抗肿瘤治疗的患者;2.既往经医院确诊为心力
背景与目的:肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤,其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）约占85%。近年来,随着对肿瘤发生机制研究的不断深入,肿瘤驱动基因的不断发现,特异性高、毒副反应低的分子靶向治疗也越来越多地受到人们的关注。棘皮动物微管相关蛋白4（echinoderm microtubule associaed protein-link 4,EML4）与间
结核病,一种由结核分枝杆菌感染引起的传染性疾病,一直以来都威胁着全球的公共健康。近些年由于艾滋病结核共感染以及多重耐药结核分枝杆菌菌株的出现,现有的结核药物已经不能满足治疗结核病和控制结核病传播的需求。因此,开发新的抗结核药物或者探索传统药物在治疗结核方面的新作用是一个紧迫的任务。现阶段抗结核药物筛选方法主要有两种:一种是表型筛选（全细胞筛选）;另一种是基于特异性靶标进行的化合物筛选。本课题就是基
背景及意义:全球精神分裂症的患病率高,给社会带来沉重负担,占用了大量的医疗资源,已成为重要的全球公共卫生问题。目前精神分裂症的治疗方法主要是对症治疗,有一定的局限性。越来越多的证据表明,肠道菌群的紊乱与精神疾病的发生相关,可能通过菌群相关的神经递质、免疫因子、代谢产物组发挥作用。其中,代谢为基础,具体机制需要进一步探讨。因此,本文探讨肠道菌群变化与精神分裂症发生、发展之间的关系及机制,以期为开辟精
背景和目的大肠癌,分为结肠癌和直肠癌,是全世界范围内最常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率仅次于肺癌和乳腺癌,位居全世界所有恶性肿瘤的第三位,死亡率也高居第五位,多数大肠癌患者临床发现时已属于中晚期,因此,发现大肠癌新的早期诊断和预后相关指标,深入研究大肠癌发生发展的分子机制,从而提高临床对大肠癌的诊治水平成为当前大肠癌的研究热点。人端粒酶逆转录酶（hTERT,human telomerase re
目的:近些年来,越来越多的研究试验发现,机体的系统性炎症与恶性肿瘤的产生、进展和转移之间有着非常紧密的联系。NLR（Neutrophil-Lymphocyte Ratio,中性粒细胞-淋巴细胞比率）,与众多恶性肿瘤,包括:食管鳞状细胞癌、胃癌、肝细胞癌、喉癌、膀胱癌和NSCLC（Non-small Cell Lung Cancer,非小细胞肺癌）等局限期以及晚期恶性肿瘤患者的预后相关。本文拟建立N
研究背景:结直肠癌（colorectal cancer,CRC）又称为大肠癌,是消化系统最常见的恶性肿瘤之一。迄今为止,结直肠癌的发病机制尚未完全阐明,有研究表明结直肠癌死亡率迅速增长的主要原因是肿瘤的复发和转移,其中最常见的是淋巴结转移。因此,抑制结直肠癌的侵袭与转移是提高患者生活质量、延长患者寿命的重要途径。近年来,已有大量研究证实,趋化因子和趋化因子受体在恶性肿瘤的增殖、侵袭及转移中发挥重要
目的:研究脑电双频谱指数在颅脑术后颅内感染早期诊断中的临床价值与意义。背景:颅内感染是神经外科颅脑手术后常见的严重并发症,影响着术后病人的治疗效果和预后情况。目前国际上的统计数据表明,颅脑手术后颅内感染的发病率介于1.1%和2.5%之间。颅内感染最常发生于术后的3-7天内。术后颅内感染有着较高的致残率和死亡率。故早期准确诊断颅脑术后颅内感染,具有重大的临床意义。但是,目前术后颅内感染早期诊断的常用
目的:1.探讨肠道菌群与乙醇代谢能力之间的关系并筛选具有高代谢能力的菌株。2.探讨不同益生菌株对小鼠急性酒精中毒的缓解作用及机制。3.探讨不同来源同种益生菌株对小鼠急性酒精中毒缓解作用的差异。4.探讨联合益生菌株对小鼠急性酒精中毒的缓解作用及机制。方法:1.利用比色法测定人粪便和粪便全菌中乙醇脱氢酶（ADH）、乙醛脱氢酶（ALDH）活性。2.利用菌群分离鉴定技术,筛选益生菌候选菌株。3.采用乙醇灌
目的制备社会隔离动物模型,探讨社会隔离对BALB/c小鼠行为的影响及其5羟色胺2C受体（5-HT2C receptor,5-HT2CR）的RNA编辑作用机制。给予5-HT2CR拮抗剂和反向激动剂进行干预,进一步分析5-HT2CR的RNA编辑在社会隔离对BALB/c小鼠行为影响中的作用,为揭示社会隔离引起的相关精神障碍疾病的发病机制和防治策略提供依据。方法选取健康雄性BALB/c小鼠,按照随机原则分