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目的创建新的巨噬细胞(MΦ)上Pdl1特异性敲除的小鼠结核模型,明确MΦ上Pdl1在结核感染中的免疫作用。方法构建Pdl1Flox/+小鼠,通过Cre-loxp技术培育出MΦ上Pdl1特异性敲除的纯合和杂合小鼠(Pdl1Flox/Flox_Cre,Pdl1Flox/+-Cre),用PCR和流式细胞术验证敲除是否成功。用2×106 CFU的结核菌标准株H37Rv菌液经尾静脉分别感染雌性和雄性的纯合、杂合及同窝阴性小鼠,4周后解剖小鼠,通过BACTEC MGIT 960培养法与罗氏(Lowen ste i n-J eusen,L-J)培养法两种方法来检测小鼠肺、脾、肝脏组织荷菌量,并分析组织病理病变,判定巨噬细胞上Pdl1特异性敲除的小鼠结核模型是否建立成功,分析上述小鼠模型中荷菌量和病理变化,研究巨噬细胞上PD-L1的体内作用。同时用PD-L1、PD-1功能性抗体干预2×106 CFU H37Rv感染的C57BL/6小鼠,在第3d、10d、17d分别连续给予PD-L1同型抗体(250μg/只/周),PD-L1抗体(250μg/只/周)和PD-1抗体(250μg/只/周),于第4周解剖小鼠,分析组织病变和荷菌量,研究小鼠中广泛分布的PD-L1和PD-1在结核感染中的作用。结果PCR法成功检测出子代小鼠基因型,包括Pdl1Flox/Flox-Cre,Pdl1Flox/+-Cre和Pdl1Flox/Flox小鼠。流式细胞仪检测上述品系小鼠的巨噬细胞、T细胞和B细胞的PD-L1 的表达百分比,其中Pdl1Flox/Flox-Cre 小鼠、Pdl1Flox/+-Cre 和Pdl1Flox/Flox小鼠巨噬细胞 PD-L1的表达百分比分别为 4.4±2.8%,40.9±3.5%,87.4±3.8%,Pdl1Flox/Flox-Cre小鼠与后两者相比显著偏低(P<0.001),而T、B细胞上PD-L1表达未见明显变化。PCR和流式检测证实巨噬细胞上Pdl1特异性敲除小鼠制备成功。上述小鼠感染结核菌4周后,960培养系统肺、脾、肝脏的报阳时间(h)与罗氏培养法肺、脾、肝脏的菌落数(LgCFU/mL)共同表明PD-1抗体与PD-L1抗体均能显著降低C57BL/6小鼠靶器官的荷菌量(P<0.05,P<0.05),在Pdl1特异性敲除的不同亚品系小鼠中,Pdl1Flox/Flox♀感染组肺、脾、肝脏组织荷菌量(LgCFU/mL)分别为5.22±0.17,5.65±0.11,4.94±0.18,Pdl1Flox/+-Cre 与Pdl1Flox/Flox-Cre 感染组靶器官的荷菌量均增加,其中Pdll1Flox/Flox-Cre♀感染组肺、脾、肝脏组织荷菌量(LgCFU/mL)分别为5.83±0.12,5.78±0.16,5.35±0.10,增加最显著(P<0.05),此外各亚品系的性别差异对荷菌量无明显影响。各组肺脏、脾脏病变比值(%)与肝脏内肉芽肿密度(number/mm2)结果表明PD-1抗体与PD-L1抗体均能显著减轻C57BL/6小鼠靶器官的病理病变(P<0.001,P<0.001)。Pdl1Flox/Flox♀感染组肺、脾脏病变百分比(%)分别为 4.61±0.17,4.06±0.25,肝脏内肉芽肿密度(number/mm2)为 1.98±0.11,Pdl1Flox/+-Cre与Pdl1Flox/Flox-Cre感染组靶器官的病变均加重,其中Pdl1Flox/Flox-Cre♀感染组肺、脾脏病变百分比(%)分别为10.42±0.53,8.03±0.48,肝脏内肉芽肿密度(number/mm2)为5.09±0.11,病变最为严重(P<0.001),此外各亚品系的性别差异对病理病变无明显影响。结论通过PCR和流式细胞术证实特异性敲除小鼠制备成功。结核菌感染敲除小鼠后,小鼠肺脾肝出现结核相关的病变,并且荷菌量维持在较高水平,病变和荷菌量参数稳定,因此新的巨噬细胞特异性Pdl1敲除小鼠结核模型建立成功。巨噬细胞特异性Pdl1敲除的纯合小鼠(Pdl1Flox/Flox-Cre)在感染4周后,小鼠肺、脾和肝脏组织的荷菌量显著增加,并出现组织肉芽肿,多种炎性细胞浸润等病变。而PD-L1抗体广泛性干预后,小鼠肺、脾和肝脏的荷菌量显著减少,病变减轻,两者存在不同的效果,可以为PD-L1在结核中的作用和机制研究提供实验数据。目的通过细胞程序性死亡受体-配体1(Programmed cell death ligand 1,PD-L1)抗体敲低巨噬细胞上PD-L1表达,研究PD-L1对结核菌感染的巨噬细胞吞噬杀伤的作用和机制。方法通过结核菌(Mrf)以不同的感染复数M0I5(细菌数:细胞数=5:1)及MOI10(细菌数:细胞数=10:1)感染巨噬细胞系(RAW264.7细胞)3h后,加入PD-L1抗体(10μg/mL),以PD-L1同型抗体为抗体对照(l0μg/mL),采用流式细胞术检测HTC标记的结核菌荧光强度,以反映PD-L1对结核菌感染的巨噬细胞吞噬功能的影响;通过检测结核菌感染巨噬细胞内活菌数量及活性氧(ROS)水平来研宄巨噬细胞的杀伤功能,即24h及48h后,采用BACTEC MGIT 960培养法与罗氏培养法两种方法来检测各组细胞内活菌数量,利用流式细胞术检测各组细胞中的荧光细胞比例来反映ROS水平。在明确巨噬细胞的吞噬杀伤功能后,采用高通量液相蛋白芯片检测感染24h及48h细胞上清中的细胞因子来探讨影响吞噬和杀伤功能的分子作用机制。结果结核菌感染巨噬细胞后,感染复数MOI10较MOI5,胞内含有FITC-M^的细胞比例显著增加(P0.001),而且PD-L1抗体在MOI10时,含有FITC-MA的细胞比例也显著增加(P<0.01)。结核菌感染过程中(24h到48h),PD-L1抗体在MOI10能显著增强巨噬细胞对胞内菌的杀伤作用,细胞内ROS含量明显升高(P<0.01),而在MOI5抑制巨噻细胞的杀伤作用,并显著降低胞内ROS的产生(P<0.05)。高通量液相蛋白芯片检测发现,PD-L1在24h特异性促进MOI5的各组IL-10分泌,促进MOI10的各感染组TNF-a分泌;PD-L1在48h特异性激活MOI5的各组IL-13,IL-22分泌,及促进MOI10的各感染组IL-lp、IL-6、IL-18的GM-CSF分泌,抑制IL-4分泌。结论PD-L1抗体在MOI5体系中促进巨噬细胞IL-10、IL-13与IL-22的分泌,减少ROS的产生,抑制巨噬细胞的杀伤作用,而在MOIIO体系中,促进IL-lβ、IL-6、IL-18、GM-CSF及TNF-a的分泌,抑制IL-4分泌,胞内ROS水平升高,从而增强巨噬细胞对结核菌的吞噬和杀伤作用。目的分析结核菌感染的程序性死亡配体1 w//)特异性敲除的巨噬细胞转录谱变化,筛选巨噬细胞内PD-L1作用相关的候选基因。方法分离MФ上pdl1特异性敲除的纯合和杂合小鼠(?)Ftox-Cre,-Cre)腹腔巨噬细胞,利用转录组测序技术检测结核菌以MOI5与MOI10感染巨噻细胞24h的转录谱,以同窝阴性小鼠为对照,进行生物信息学分析。结果纯合、杂合及同窝阴性小鼠感染前后相比,MOI5感染组与MOI10感染组差异表达基因最显著富集项均为参与免疫反应的GO:0006955(P<0.01)与参与免疫系统过程的GO:0002376(P<0.01),筛选出22个PD-L1相关的候选基因。结论通过KEGG富集分析,MOI5感染组与MOI10感染组最显著富集的通路包括Toll样受体信号通路、NF-kB信号通路、HIF-1信号通路及TNF信号通路(P<0.01;P<0.01;P<0.01;P<0.01),筛选出16个候选基因=结论通过转录谱分析,确定与免疫反应及免疫过程有关的Cxc//、CW2、等22个基因,免疫及炎症相关代谢通路的Ptgs2、Cd40、Cardll/Bcl3等16个基因为结核菌感染的巨噬细胞内PD-L1相关的候选基因,除//6外均为本研究新筛选的候选基因。