牛瑟氏泰勒虫病是由泰勒科、泰勒属的瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti)寄生于牛的红细胞内而引起的一种以高热、贫血、消瘦和体表淋巴结肿大等临床症状的一种血液原虫病。在我国该病的流行区域逐年扩大,发病率和死亡率呈现上升趋势,对养牛业的危害较为严重,已经引起兽医界的普遍重视。牛瑟氏泰勒虫的抗原成分较为复杂,主要有p23、p32、p33表面蛋白等。p33表面蛋白作为一种红细胞感染阶的膜内蛋白,免疫原性较好,在抗牛瑟氏泰勒虫感染中具有重要作用。本研究根据已报道的瑟氏泰勒虫p33表面蛋白的基因序列,分别设计了两对特异性的引物,以牛瑟氏泰勒虫基因组DNA为模版,克隆出两个大小为723 bp的p33基因。应用SOE-PCR技术获得大小约为1422 bp的双拷贝p33基因,并将该双拷贝p33基因先克隆到pMD18-T-Simple载体,再将其亚克隆到pVAX1真核表达载体中,构建重组质粒pVAX1-2p33。对重组质粒pVAX1-2p33采用PCR、酶切及测序的方法进行鉴定后,利用脂质体转染法将转染其到BHK-21细胞后进行RT-PCR和IFA鉴定,经鉴定正确后,采用质粒大量提取试剂盒大量提取重组质粒pVAXl-2p33,并将该质粒腿部肌肉注射免疫小鼠,应用间接ELISA和流式细胞技术对双拷贝的pVAX1-2p33质粒的免疫效果进行检测。间接ELISA试验结果表明,在相同免疫剂量下,重组质粒pVAX1-2p33免疫组在免疫后的地14d可刺激免疫小鼠产生特异性抗体,但抗体水平较低,上升趋势不明显。但在免疫后的第28 d后抗体呈明显的上升趋势,且42 d时到达顶峰,而且pVAX1-2p33免疫组的抗体效价明显高于pVAX1-p33免疫组(P<0.01),表明2p33的体液免疫水平显著高于p33。流式细胞检测结果表明,重组质粒pVAX1-2p33、pVAX1-p33均能使CD4+、CD8+上升,刺激小鼠产生细胞免疫效果,但二者总体的细胞免疫水平差别不显著(P>0.05)。本结果将为牛瑟氏泰勒虫DNA疫苗的研究奠定了基础。