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目的：
通过建立常压缺氧性肺动脉高压动物模型,分别以肺动脉高压、肺血管形态学、右心指数和动脉血气的改变为指标,将复方作为一个整体,采用不同的中药制剂配方组成,将复方水煎液进行动物的药效学研究,进而确定哪个方案更具临床疗效。然后对该方案进行动物毒性实验研究,探讨该复方的药物安全性,为进一步的研究就是探讨中药的现代化运用成分研究,赋予传统的中医方药以现代的科学内涵,为临床开发安全有效、质量可控的治疗HPH的中药新药奠定基础。
方法：
实验分不同中药制剂水煎液药效实验及复方茯苓甘草汤水煎液对SD大鼠的毒性实验两个部分。
1.不同中药制剂水煎液药效实验:照薛全福等[62]的方法并略改动。采用SPF级SD系雄性大鼠50只,体量200~220g,随机分组分为空白组、对照组、饮片组、免煎组和再煎组,每组10只。大鼠按组别置于缺氧舱内,控制舱内氧浓度在10±0.5％范围。每天缺氧8小时,连续缺氧21天。空白组不缺氧,每天予生理盐水4ml灌胃,其余各组缺氧前每天予药液4ml灌胃。21天后行右心导管法检测大鼠平均肺动脉压(mPAP),然后处死大鼠,取完整右下肺常规石蜡包埋切片,行HE及Weigert弹性纤维染色,光镜下观察并计数肺小血管(15μm＜外径≤50μm)中肌型动脉(MA)、部分肌型动脉(PMA)和无肌型动脉(NMA)的数目,分别计算占肺小血管总数的百分比。利用图像分析系统测量肺中小型动脉相对中膜厚度(RMT)及面积(RMA)。并进行肺大疱面积比例的计算,每只大鼠选一相同肺组织横向切片,每张切片用Leica Qwin图像分析系统测定肺大疱总面积(SB)、肺组织总面积(SL),计算肺大疱总面积与肺组织总面积的比值(SB/SL)。计算右心肥厚指数[RV/(LV+S)]。心脏采血5ml,装入抗凝管中,冷藏箱保存,急送检验进行动脉血气分析。检测相关指标,采用SPSS13.0统计软件进行分析:计量资料用((x)±s)表示,多样本均数比较用单因素方差分析,先进行方差齐性检验,总体方差齐时用Bonferroni法,方差不齐时用Tamhanes T2法,P＜0.05时差异有统计学意义,比较不同中药组分制剂对防治肺动脉高压疗效结果。
2复方茯苓甘草汤水煎液对SD大鼠的毒性实验:
2.1复方茯苓甘草汤水煎液不同浓度剂量分组:
急性毒性组—因在预实验中无法测出LD50,故进行了大鼠一天多次灌胃给药的最大给药量的测定,结果最大给药量600g生药/kg,相当于人用剂量100倍,人用剂量为1g生药/kg,人体重以60kg计。
高剂量给药组—全方药物按生药材比例称量,以360g生药/kg混悬液,相当于人用剂量的60倍,浓缩成6g生药/ml浓度,罐封冷藏备用。
中剂量给药组—全方药物按生药材比例称量,以180g生药/kg混悬液,相当于人用剂量的30倍,浓缩成6g生药/ml浓度,罐封冷藏备用。
低剂量给药组—全方药物按生药材比例称量,以90g生药/kg混悬液,相当于人用剂量的15倍,浓缩成6g生药/ml浓度,罐封冷藏备用。
2.2动物筛选与验证SPF级SD系雌雄各半大鼠100只,体重200~220g,随机分组分为空白组、急性毒性组、高剂量组、中剂量组和低剂量组,每组20只。空白组不给药,每天予生理盐水自由饮用,急性毒性组一天5次灌胃,4ml/次,其余三组每天按浓度限量配水饮用。分别于给药30天后及停药14天后随机选取一半大鼠处死,完整剪下心脏、肝脏、肾脏、脾、肺、肾脏、子宫、睾丸、卵巢、附睾、肾上腺,冰盐水洗净并经滤纸吸干后,电子天平称量重量,计算脏器指数[R·(L+S)-1]。各器官取部分组织用福尔马林固定,常规石蜡包埋切片,行HE及Weigert弹性纤维染色,光镜下观察各组织形态结构是否异常。心脏采血2ml,装入抗凝管中,冷藏箱保存,急送血液学检测。心脏采血3ml,装入促凝管中,冷藏箱保存,急送生化学检测。数据分析采用SPSS13.0统计软件,计量资料数据均采用均数±标准差((x)±s)表示,多组之间比较采用方差分析,以.P＜0.05具有统计学意义。
结果：
1.慢性缺氧21天后,B组大鼠的mPAP、RV/(LV+S)、wW/BW、MA(%)、PMA(%)、MA/LA比值比A组的均明显升高(P＜0.01),而NMA(%)则明显降低。右心肥厚,肺小动脉内皮细胞细胞破坏,中膜增厚,外膜炎性细胞浸润,管壁细胞外基质异常沉积,管腔狭窄,无肌型及部分肌型动脉肌化,显示慢性缺氧性肺动脉(PAH)高压大鼠模型成功建立。
2.经治疗后C组、D组、E组的mPAP、RV/(LV+S)、wW/BW、MA(%)、PMA(%)、MA/LA比值与B组的比较,均有所下降(P＜0.01),但未能恢复到A组水平(P＜0.01)。另外,C组、D组、E组之间的mPAP、RV/(LV+S)、wW/BW相比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。但三组相比较,C组最高,D组次之,E组最低。C组、D组、这两组的肺小动脉内皮细胞细胞连续性破坏,中膜平滑肌细胞增生、内外弹力层距离、管壁ECM沉积及外膜炎性细胞浸润均较B组减轻,肺泡间无肌型动脉肌化现象减少,总体改善以C组最明显。E组的肺小动脉内皮细胞细胞连续性受破坏程度较B组轻,但较C组、D组稍重,中膜平滑肌细胞出现增生肥大,内外弹力层距离稍增宽,外膜炎性细胞浸润,管壁增厚,管腔狭窄或呈不规则样,肺泡间无肌型动脉内膜轻度增生肥厚,弹力纤维有增生,并出现平滑肌。
3.可认为中药饮片水煎液和免煎颗粒水溶液在防治常压缺氧性PAH大鼠无论是在器质性和功能性效果无明显差异,而结合经济及便利性方面的考量,在接下来的复方茯苓甘草汤的毒性实验里,我们选择性价比更高的中药饮片作为实验药品。
4.按最大浓度、最大容积给药,大鼠口服复方茯苓甘草汤中药饮片水煎液的MTD为120g/kg:按一天内多次最大量给药,口服复方茯苓甘草汤中药饮片水煎液的MTD为600g/kg。给药1天后,20只大鼠神疲乏力,少气懒动,扎堆取暖,大便稀溏未见小鼠口、鼻、眼有异常分泌物出现。第14天,20只大鼠与别组大鼠状况无明显差异,一般状况良好,活动、食量正常,无死亡情况。
5.大鼠连续给药复方茯苓甘草汤30d后,Ⅲ组白细胞计数与Ⅰ组相比有差异性(0.01＜P＜0.05),Ⅳ组、Ⅴ组两个剂量组的AST值升高,与Ⅰ组相比具有差异性高(P＜0.01),停药后1天,将受试动物随机选取一半处死,取心、肝、脾、肺、肾、胃、肠等经肉眼观察,外观、形态、大小及颜色均正常,未发现充血、肿胀及坏死等异常现象;给药组动物的脏器系数与对照组比较无显著性差异(P＞0.05),将上述组织器官经病理组织学检查,亦未见组织萎缩、增生、炎细胞浸润及细胞退行性变等明显病理变化及与中毒有关的病理性改变。
6.停药14d后,大鼠摄食量、体重、行为活动、血象和重要器官脏器系数均正常;病理学检查,各组各脏器均未发现明显变化。
结论：
1.复方茯苓甘草汤的中药饮片水煎液、免煎颗粒水溶液、免煎颗粒再煎液对防治常压缺氧性PAH大鼠模型都是有效的。而三者相比较起来,中药饮片水煎液、免煎颗粒水溶液的效果较免煎颗粒再煎液更为明确。
2.复方茯苓甘草汤中各成分的中药饮片及免煎颗粒的疗效无明显差异性,这六种中药的饮片制剂及免煎制剂的一次煎煮效果接近,而免煎颗粒在水溶解后再煎煮对肺动脉高压的疗效略逊于首次溶解。
3.复方茯苓甘草汤可采用免煎颗粒代替传统的中药饮片。
4.按最大浓度、最大容积给药,大鼠口服复方茯苓甘草汤中药饮片水煎液的MTD为120g/kg:按一天内多次最大量给药,口服复方茯苓甘草汤中药饮片水煎液的MTD为600g/kg。
5.大鼠连续给药30d后,Ⅲ组白细胞计数升高为过量用药后反应的一过性升高。Ⅴ组的AST显著升高原因为心脏取血时人为因素地产生额外手术创伤,因AST的敏感性较ALT高。而Ⅳ组前后AST升高无显著差异性,但ALT与Ⅰ组无明显差异性(P＞0.05)。给药组动物的脏器系数与对照组比较无显著性差异(P＞0.05),提示复方茯苓甘草汤长期给药对动物主要器官的生长发育无明显影响。
6.停药14d后,大鼠摄食量、体重、行为活动、血象和重要器官脏器系数均正常;病理学检查,各组各脏器均未发现明显变化。
7.复方茯苓甘草汤的成人日用量3600g/60kg以下用量是安全的。