论文部分内容阅读
狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies Virus)引起的中枢神经系统感染的人畜共患传染病，发病后几乎全部以死亡而终。本研究旨在用免疫信息学和重组表达技术制备特异性诊断重组蛋白，并建立ELISA快速检测狂犬病毒抗体水平的方法。
狂犬病病毒为弹状病毒科，狂犬病病毒属，基因组分别编码核蛋白(NP)、转录酶蛋白(LP)、基质蛋白(MP)、磷酸化蛋白(MS)和糖蛋白(GP)。其中，糖蛋白可刺激机体产生中和抗体，核蛋白是最保守的具有免疫原性的结构蛋白。
本研究根据文献中狂犬病病毒核蛋白(NP)与糖蛋白(GP)基因保守序列设计引物，从狂犬病疫苗未知灭活毒株中提取病毒RNA，通过一步法RT-PCR获得糖蛋白与核蛋白基因的全长，亚克隆至原核表达载体pET-His中，转化E.coli Rosetta(DE3)，IPTG诱导表达。菌体裂解物经SDS-PAGE分析，分别得到53KD、60KD的蛋白，与预期相符。Western印迹检测表明， NP、GP重组蛋白可被抗狂犬病血清识别。通过Ni-NTA纯化NP、GP包涵体，并采用间接酶联免疫吸附方法(IELISA)对NP、GP纯化蛋白特异性进行鉴定后表明：NP重组蛋白可有效地区分阳性血清与阴性血清。以NP为抗原，通过对其最佳稀释度、灵敏度、特异性、重复性和稳定性的检测，建立起狂犬病毒血清水平的间接ELISA检测。本实验用基因工程方法表达的病毒蛋白作为检测抗原，可以在短的时间内生产出大批高纯度的检测抗原，大大降低了检测的成本：与常用的用灭活病毒做包被抗原相比，杜绝了安全隐患，降低了检测风险。此方法可为我国养殖犬进行狂犬病检测及人和犬接种疫苗后血清抗体水平的监测提供现场快速的检测手段，进而提高我国在狂犬病检测、防治方面的能力，在此基础上建立起我国的狂犬病预警机制，以保障我国人民的生命财产安全。