单环刺螠(Urechis unicinctus)是一种在我国黄、渤海海区新兴的海水养殖经济物种,其肉味鲜美,营养丰富,具有极其巨大的经济价值。但随着过度捕捞以及环境破坏,单环刺螠资源已经呈现衰退趋势,单环刺螠市场价格也不断攀升。人工养殖以及有计划的增殖放流迫在眉睫。虽然在山东地区人工育苗已经有所突破,但其地理种群遗传分析与遗传结构差异方面的研究还未曾报道,而发展的日趋成熟的微卫星标记辅助育种技术为水产养殖品种的人工良种选育以及快速繁育工作提供了可行而有效的工具。本研究基于RAD(restriction association site DNA)高通量测序法短时间获得大量单环刺螠微卫星序列,经过层层筛选,最终开发出22对高多态性微卫星标记。进而利用这些微卫星标记对黄渤海海区5个野生地理群体(山东省烟台市YT、山东省潍坊市WF、山东省青岛市QD、河北省秦皇岛市QHD、辽宁省大连市DL)进行群体遗传结构的分析和评估。1.单环刺螠微卫星标记的开发首先,利用改良后的酚—氯仿—异戊醇抽提法提取高质量的单环刺螠DNA,进而进行以Illumina HiSeq2500平台的单环刺螠RAD文库的构建,再对所得数据进行过滤和统计分析,本次测序共产生Raw data 2.113G,过滤后的Clean data2.109G,测序质量情况为Q20>=96.76%、Q30>=92.22%,GC含量40.06%,而组装后GC含量39.98%,两者相差较小。从组装后的序列片段中检测到大量杂合单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点和少量的纯合单核苷酸多态性位点,杂合度约为96.5%,从以上结果基本可以认为RAD测序的结果准确可靠。本次测序共检测到SSR序列1287个,其中测得三核苷酸微卫星为818个,数量最多,约占总数的63.56%。为微卫星序列长度在18bp以上的序列设计引物,挑选微卫星序列长度在24bp以上的50个序列进行引物合成。并通过一个30个个体的秦皇岛单环刺螠野生群体对这50对引物引物进行筛选,其中能稳定扩增出清晰目的条带的38对,其中22对具有多态性。22个微卫星序列全部为完美型(Perfect)。其中二核苷酸微卫星5个(22.73%),三核苷酸微卫星14个(63.64%),四核苷酸微卫星2个(9.09%),五核苷酸微卫星1个(4.55%)。以QHD群体30个个体DNA为模板共检测出等位基因多达234个,每个微卫星位点的等位基因数(Na)在7—16之间,平均等位基因数(Na)为10.636;有效等位基因数(Ne)在4.369—13.534之间,平均有效等位基因数为8.096个;平均观测杂合度(Ho)和平均期望杂合度(He)的值分别为0.790和0.883。多态信息含量(PIC)平均值为0.854,UuS34位点的多态信息含量(PIC)最低,其值为0.736,UuS9位点最高,数值达到了0.921,22个微卫星标记均为高多态性标记。2.5个野生地理群体遗传结构的分析利用前文开发的22个高多态性微卫星标记,对黄渤海海区5个野生地理群体进行遗传结构的分析。结果表明:22个微卫星位点在5个群体中均表现为高多态性,以5个群体来看,每个标记检测到等位基因数(Na)介于24—44之间,多态信息含量(PIC)介于0.921—0.967之间。5个群体总的平均有效等位基因数(Ne)范围为6.629—8.850,平均观测杂合度(Ho)和平均期望杂合度(He)范围分别为0.790—0.912、0.851—0.896,DL群体的杂合度最大(He=0.8962),WF群体的最小(He=0.8510)。平均遗传分化指数(FST)表明,群体分化水平处于中等分化水平,FST值为0.0880—0.1136,WF群体分化最小,而DL群体分化最为明显。这说明5个单环刺螠群体的遗传多样性较为丰富,其中DL群体的遗传多样性在5个群体中最高,而WF群体为最低;22个微卫星标记中有12个标记在不同群体中出现显著偏离Hardy—Weinberg平衡的现象;从Nei’s标准遗传距离来看,YT和DL群体遗传距离最远,说明两群体间亲缘关系最远;而YT和QD群体遗传距离最近;DL群体与其他群体均有较远的遗传距离。根据Nei遗传距离采用UPGMA法进行图聚类分析显示烟台群体先与青岛群体聚为一支,再与秦皇岛群体聚类,然后跟潍坊群体聚为一支,大连群体单独聚为一支;遗传距离模式(IBD)显示单环刺螠群体的遗传距离与地理距离间不存在显著的线性关系。以上结果表明,黄渤海海区单环刺螠遗传丰富度较多,但群体分化程度并不大,其中YT与DL群体遗传距离最大,可能是由于黄渤海海区海流在一定程度上阻断基因交流造成的。本研究开发的微卫星标记可以用于单环刺螠微卫星多态性、群体多样性、遗传学分析和种群进化等研究,也可为加强单环刺螠种质资源保护与管理以及将来良种人工选育工作提供指导。