口腔粘结学,是近代口腔医学发展最为迅速、最为有效的新技术之一,是现代牙科美容修复及口腔保存修复的重要基础。目前,酸蚀技术的应用使牙釉质粘结获得了较理想的粘结强度,但由于牙本质自身结构的复杂性,它与不同粘结系统的粘结效果及持久性仍是一个技术难点。作为牙本质有机物主要成分的胶原纤维,是牙本质粘结界面的主要成分之一。在完全去除或保留玷污层后,粘结剂与牙本质脱矿后暴露的胶原纤维网相互作用形成了混合层。但是,无论是全酸蚀还是自酸蚀粘结系统,形成的混合层在长期受到口内环境中水及酶等各种因素的影响下,未聚合的树脂单体及水溶性分子会从胶原纤维的表面剥脱,导致胶原纤维暴露,而暴露的胶原纤维有可能在牙本质内固有的基质金属蛋白酶的作用下发生降解,使混合层的有机成分损耗,引起粘结界面的退行性变,导致粘结破坏。因此,粘结界面混合层内胶原纤维的降解对于牙本质粘结强度及耐久性的影响不仅是粘结降解机理中亟待解决的问题,而且问题的解决有可能推动粘结退化理论的进一步发展。本课题首先从胶原降解量和胶原纤维形态学两个方面,评价了牙本质粘结的首要步骤——酸蚀对于牙本质内I型胶原纤维降解的影响;进而对牙本质进行不同粘结系统及浸泡老化处理,通过微拉伸实验测定牙本质粘结强度;同时应用酶联免疫吸附法定量测定胶原降解水平,免疫胶体金技术与场发射扫描电镜相结合对粘结界面混合层胶原纤维的降解以及混合层形态进行微观分析,探讨I型胶原纤维降解以及粘结强度随时间的变化趋势,以及两者的相关关系。本实验的实施为牙本质粘结耐久性的研究提供了直接理论基础和一定的实验依据。主要实验结果如下:1.酸蚀时间对牙本质内I型胶原纤维降解量影响的实验结果显示,随着37%磷酸处理牙本质时间的延长,胶原降解量呈增加趋势,酸蚀60 s降解的胶原最多,为4.86(1.55) mg/g,30 s次之,为2.76(0.87) mg/g,15 s组为1.93 (0.88) mg/g,10 s胶原降解量较少,为0.95(0.38) mg/g,空白对照组也有少量降解,为0.06(0.03) mg/g,两两比较,各组间均具有统计学差异(P<0.005)。2.酸蚀时间对于牙本质内I型胶原纤维形态学影响的实验结果表明,通过场发射扫描电镜观察,37%磷酸酸蚀处理牙本质10 s可清除玷污层,但微粒样物质仍覆盖于牙本质小管口及胶原纤维表面。酸蚀15 s可使牙本质小管口清晰开放,可观察到主纤维及球状附着物。酸蚀30 s暴露的胶原纤维表面更加光滑,球状附着物减少,可观察到次级纤维。酸蚀60 s暴露的次级纤维数量增加,主纤维数量减少,牙本质小管管内结构塌陷,存在纤维断裂的征象。3.浸泡老化对不同牙本质粘结系统粘结强度影响的实验结果显示,一步自酸蚀粘结系统的即刻粘结强度为24.07±7.47 MPa,显著低于两步自酸蚀粘结系统29.53±7.13 MPa及全酸蚀粘结系统29.81±7.34 MPa,具有统计学差异(P<0.05)。随着人工唾液浸泡时间增长,各粘结系统的粘结强度均有所下降。浸泡1月,一步自酸蚀系统的粘结强度为22.11±7.16 MPa,显著低于两步自酸蚀系统28.88±10.52 MPa及全酸蚀系统28.25±9.32 MPa,具有统计学差异(P<0.05);浸泡4月,一步自酸蚀系统的粘结强度为20.55±6.06 MPa,均数低于全酸蚀粘结系统21.21±6.39 MPa,高于两步自酸蚀系统18.96±5.31 MPa,但组间无统计学差异。对于一步自酸蚀粘结系统,其粘结强度的均数随浸泡时间延长而降低,但无统计学差异;对于两步自酸蚀系统及全酸蚀系统,各自浸泡4月的粘结强度显著低于浸泡1月以及即刻组,具有统计学差异(P<0.05)。在即刻、浸泡1月、4月3个时间点,两步自酸蚀系统和全酸蚀系统的粘结强度两两比较,均未见统计学差异。4.浸泡老化及不同粘结系统对牙本质内I型胶原纤维降解量影响的实验结果显示,一步自酸蚀粘结系统的即刻胶原降解量为0.18±0.01 mg/g,显著高于两步自酸蚀粘结系统0.16±0.01 mg/g以及全酸蚀粘结系统0.15±0.01 mg/g,具有统计学意义(P<0.05)。随着人工唾液浸泡时间延长,各粘结系统的胶原降解量均随之增高。浸泡1月,两步自酸蚀粘结系统胶原降解量为0.16±0.01 mg/g,显著低于全酸蚀粘结系统0.18±0.01 mg/g和一步自酸蚀粘结系统0.19±0.02 mg/g,存在统计学意义(P<0.05)。浸泡4月,一步自酸蚀粘结系统的胶原降解量为0.26±0.01 mg/g,两步自酸蚀粘结系统为0.21±0.02 mg/g,全酸蚀粘结系统为0.19±0.02 mg/g,组间存在统计学差异(P<0.05)。对于全酸蚀粘结系统,即刻胶原降解量显著低于浸泡1月及4月组,具有统计学意义(P<0.05),提示其在浸泡初期出现了胶原的大量降解;对于一步自酸蚀粘结系统和两步自酸蚀粘结系统,浸泡4月的降解量显著高于1月及即刻组,具有统计学差异(P<0.05),提示自酸蚀粘结系统是随着浸泡时间的延长,呈现胶原降解量的逐渐增多。一步自酸蚀粘结系统,较两步自酸蚀粘结系统,各时间点的胶原降解量大,存在统计学差异(P<0.05)。5.牙本质内I型胶原纤维降解量与粘结强度相关性分析的实验结果显示,I型胶原纤维降解量与牙本质粘结强度存在相关关系(r=-0.65, P=0.003),并且牙本质粘结强度随着I型胶原纤维降解量的增加而下降。6.牙本质内I型胶原纤维免疫标记定性观察分析的实验结果显示,通过场发射扫描电镜观察,牙本质脱矿后暴露的I型胶原纤维,可以结合抗I型胶原单克隆抗体以及胶体金标记的相应二抗,胶体金标记颗粒分布均匀,可与暴露的胶原纤维上的特定位点结合,实现免疫定位,通过这种方法,可以直观观察胶原纤维网络的立体的空间结构。7.浸泡老化及不同牙本质粘结系统对粘结界面混合层形态学影响的微观分析的实验结果显示,全酸蚀粘结系统形成的粘结界面混合层厚度不均,可见较长的树脂突,伸向牙本质小管侧壁的树脂突起,结合二次电子和背散射电子成像,混合层表现出广泛的免疫标记,特别是深层较浅层的胶体金标记指数高;两步自酸蚀粘结系统可见致密均一的混合层以及树脂突,但胶体金标记较少;一步自酸蚀粘结系统形成的混合层存在孔洞样缺陷,个别树脂突形态存在断裂现象,胶体金颗粒于混合层内均匀分布。浸泡1月,各粘结系统均表现出混合层免疫标记的减少,全酸蚀粘结系统向牙本质小管侧壁伸出的树脂突起减少,一步自酸蚀粘结系统树脂突的数量明显减少。浸泡4月,各粘结系统均出现混合层结构的破坏,全酸蚀粘结系统混合层个别区域出现微小裂隙,自酸蚀粘结系统则出现了明显裂缝,免疫标记进一步减弱。综上所述,作为牙本质有机基质的主要成分,I型胶原的降解对于牙本质粘结强度及耐久性具有重要的意义。酸蚀牙本质表面15 s即可达到酸蚀的目的,延长酸蚀时间会导致已暴露的胶原纤维变性降解,不利于形成良好的即刻粘结。随着浸泡老化时间的延长,各粘结系统与牙本质形成的粘结界面结构完整性均随之下降,I型胶原纤维降解量均随之增加,粘结强度均随之降低,后两者存在负相关关系。