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小麦是最主要的粮食作物之一,在世界范围内分布广泛。20世纪60年代的绿色革命时期,由于高产小麦品种和优良种植技术的推广,小麦产量得到大幅度提升。但是90年代后,小麦产量的增速明显放缓,新的增产方式成为迫切需求,而提高植株光合作用正是解决问题的途径之一。光合作用是植物利用光合色素捕捉太阳能并将其转化为生命体可以存储化学能的过程。光合作用的整个过程在植物叶绿体里进行,包含光反应和碳反应两部分。其中碳反应的第一步是由核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase,Rubisco)催化进行,在此过程中,植物将空气中的一个二氧化碳分子以有机物形式固定下来,这一过程叫做固碳。固碳过程是植物能量的主要来源。Rubisco既有羧化酶活性又有氧化酶活性,但是其行使氧化酶作用时不仅没有碳的固定,而且还会消耗大量能量。由于空气中二氧化碳浓度远低于氧气浓度,导致Rubisco羧化速率非常缓慢,每秒钟只能进行3-4个反应导致Rubisco的催化反应成为整个碳反应的限速步骤。为了应对Rubisco催化作用的低效率,植物自身合成大量Rubisco。以至于在C3植物中,Rubisco占到叶片可溶性蛋白总量的50%以上,这也使得其在植物生长过程中消耗大量氮肥。 本课题通过对两个普通六倍体小麦以及四个小麦祖先种的Rubisco进行组成、结构分析,发现了可能影响Rubisco酶活的位点,同时从进化角度解释了不同进化位置上物种的Rubisco酶活差异的原因。选择的6个物种分别是:Triticum urartu(AA),Aegilops tauschii(DD),Aegilops speltoides(SS),Triticum dicoccoides(AABB),ChineseSpring和Xiaoyan54(AABBDD)。 小麦叶片的Rubisco是由8个叶绿体基因编码的大亚基和8个核基因编码的小亚基组成。相比于小亚基,大亚基的保守性较高,每个品种里只含有一个大亚基序列的拷贝,而品种之间的大亚基序列只在14位和95位氨基酸上有差异。小亚基保守性较低,不仅品种之间存在着较大的差异,同一品种内部也有高达十几种不同的序列。进一步分析不同品种的小亚基序列会发现,他们在表达上有一定的规律性。其中,对于任意一个品种,小亚基表达最高的两个序列占总共序列的85%左右,这个比例在不同品种间基本保持一致。除Aegilops speltoides外,表达量最高的两个序列在品种之间也是一致的,分别命名为A序列和B序列,但两个序列所占比例不同。进一步比较两条序列,发现二者在三个氨基酸位点具有差异:56位丙氨酸到丝氨酸的变化,83位亮氨酸到异亮氨酸的变化以及118位赖氨酸到精氨酸的变化。对6个物种Rubisco的羧化酶活性和热稳定性进行分析发现,56位丝氨酸的序列较多的Rubisco在酶活性和热稳定性上表现比较差。为了研究这三个位点在Rubisco结构中的作用,本研究纯化分离Xiaoyan54的Rubisco,并对其晶体结构进行筛选,得到1.79埃分辨率的蛋白结构。从结构分析可知,由于56位氨基酸位于大亚基和小亚基之间的连接位点,所以我们推断,此位点氨基酸的差异可能对Rubisco的酶活或稳定性产生影响。 含A序列较多的小麦品种的Rubisco具有较高的酶活。两个序列含量的多少不仅影响了Rubisco的酶活,而且两者由不同染色体上的序列编码。A序列在BB染色体上没有表达,而AA和DD染色体上A序列的表达弥补了四倍体小麦和六倍体小麦里的A序列含量,使得六倍体小麦有着近似粗山羊草的高Rubisco酶活特性。 为找到现实农业生产中植物固碳速率的影响因素,我们测定了以KN9204和J411为亲本构建的含有188个系的KJ-RIL群体的固碳速率,找到多个影响植株固碳速率的QTL位点,为将来筛选高固碳速率的高产植株提供新的思路。