利用无苞芥cDNA文库挖掘耐盐相关基因及基因功能分析

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高盐、干旱、冷害等非生物胁迫严重危害着农作物的生长,造成了农业经济的重大损失,因此植物的抗逆研究具有重要的意义。无苞芥(Olimarabidopsis pumila)为新疆半干旱半盐碱化土地上广泛生长的十字花科早春短命植物,比拟南芥更耐逆境胁迫。  本研究对无苞芥均一化cDNA文库进行分析,旨在挖掘耐盐相关基因。对无苞芥cDNA均一化文库进行大规模测序,并进行生物信息学分析和基因功能分析。通过Gateway技术构建无苞芥表达文库,转化拟南芥构建转化体库。在文库中找出无苞芥耐盐相关基因,并进行基因功能的初步分析。对无苞芥均一化cDNA文库随机挑取约2万个单克隆进行测序,并进行序列分析,包括去除低质量的EST序列和污染序列、序列拼接和装配、BLAST比对分析、功能注释、Gene Ontology(GO)分类、Cluster of orthologous Groups of proteins(COG)分类,以及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)信号通路分析。利用实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)技术分析文库中抗逆相关基因以及NAC转录因子家族基因在盐胁迫下的表达水平。利用Gateway技术构建无苞芥目的文库,转化农杆菌后侵染拟南芥,收获转化后的拟南芥种子后进行高通量筛选。利用RT-PCR方法克隆两个NAC转录因子基因OpNAC026和OpNAC083,生物信息学分析其特征,利用qRT-PCR技术分析这两个基因的表达模式,构建植物过量表达载体,获得转基因烟草植株,并进行生理指标检测。  本研究表明:⑴无苞芥均一化cDNA文库测序获得16146条高质量的EST序列,经聚类拼接后获得8893个unigenes,包括2486个contigs和6407个singletons。有4777个unigenes参与GO分类;3651个unigenes参与COG分类;8301个unigenes涉及到KEGG信号通路分析。⑵初始目的文库的库容量为4.61×104(cfu),均一化目的文库的库容量为5.96×104(cfu)。目前筛选出两株转化体植株。⑶OpNAC026基因全长cDNA为1327 bp,最大开放阅读框(ORF)为906 bp,推测编码301个氨基酸。系统进化树分析表明,OpNAC026与拟南芥AtNAC026和AtNAM进化关系最近。OpNAC026基因在无苞芥的各组织中都有表达,在叶中表达量最高;高盐胁迫处理24 h、干旱12 h、ABA6 h、4℃低温8 h明显诱导OpNAC026基因的表达。OpNAC026的转基因烟草比野生型烟草耐受逆境胁迫。⑷OpNAC083基因cDNA包含一个723 bp最大开放阅读框(ORF),推测编码240个氨基酸。系统进化树分析表明,OpNAC083编码产物与拟南芥AtNAC083和琴叶拟南芥ANAC083进化关系较近,属于同一进化分支。OpNAC083在无苞芥不同组织中都有表达,在叶中表达量最高;高盐胁迫2h、ABA处理6h明显诱导该基因的表达,但PEG-6000和4℃胁迫却抑制该基因表达。OpNAC083的转基因烟草比野生型烟草耐受逆境胁迫。
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