【摘 要】
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胫骨软骨发育不良(TD)是一种伴随着肉鸡快速增长而发生在鸡胫跗骨和跗跖骨近端的骨骼性疾病,类似于哺乳动物骨软骨病的骨骼畸形。本试验课题组前期应用基因芯片技术发现细胞
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胫骨软骨发育不良(TD)是一种伴随着肉鸡快速增长而发生在鸡胫跗骨和跗跖骨近端的骨骼性疾病,类似于哺乳动物骨软骨病的骨骼畸形。本试验课题组前期应用基因芯片技术发现细胞外脂肪酸结合蛋白(Ex-FABP)基因在肉鸡TD早期存在差异性表达,而Ex-FABP是一种由鸡的前肥大软骨细胞分泌的载脂蛋白,这提示Ex-FABP可能与肉鸡TD的发生存在密切的关系。本试验首先通过引物设计获取鸡Ex-FABP cDNA序列,同时提取肉鸡胫骨软骨生长板总RNA,PCR扩增Ex-FABP基因。构建T-Ex-FABP重组克隆载体验证Ex-FABP基因序列。序列分析正确后,将Ex-FABP目的基因序列克隆入pET-28a(+),并转入DH5α感受态细胞以获得重组表达质粒pET-28a-Ex-FABP,鉴定成功后再转入BL21(DE3)感受态细胞,对目的基因诱导表达。将表达的重组目的蛋白利用亲和层析法进行纯化并进行SDS-PAGE、Western Blot检测。本试验结果:(1)本试验成功构建T-Ex-FABP重组克隆载体,克隆基因测序结果正确。(2)本试验成功构建重组表达载体pET-28a-Ex-FABP,目的基因大量表达且获得纯度较高的重组Ex-FABP蛋白。(3)本试验采用IPTG诱导蛋白表达,最终确定的诱导条件为:IPTG浓度为0.2mM、温度30℃、诱导时间为21 h。(4)本试验SDS-PAGE检测发现Ex-FABP融合蛋白的分子量为24 kDa。(5)本试验Western Blot检测发现诱导表达的目的蛋白经纯化后在胶片呈现出一条清晰地特异性条带,可知诱导表达正确。结论:本试验利用重组DNA技术成功获得高纯度的Ex-FABP融合蛋白,为后续的动物实验奠定了基础,为TD发病机理和防治研究提供了良好的依据。
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