基于DNAzyme的铅离子检测方法的建立与研究

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铅离子是一种常见的重金属离子污染物,会在人和动物体内积累且不易排出体外。铅离子在人体内富集到一定程度,会对人体的神经系统、心血管和生殖系统等造成损伤。另外,铅离子对儿童的影响更大,严重导致发育障碍。因此,建立操作方便、灵敏度高、特异性强的生物传感器具有重要意义。本论文围绕铅离子的检测展开研究,具体如下:(1)基于DNAzyme的侧向层析试纸方法检测铅离子本方法利用DNAzyme在铅离子存在时的切割活性并结合侧向层析试纸条,开发了一种铅离子的可视化检测方法。侧向层析试纸条的C线上固定羊抗鼠二抗,T线上固定链霉亲和素(Streptavidin,SAV),金标垫上是乳胶微球与抗体的偶联物。将有无铅离子反应的DNAzyme溶液滴加到样品垫上,通过侧向层析试纸T线和C线是否显色来判断溶液中铅离子的存在情况,同时利用Image J扫描图像灰度对铅离子含量进行定量分析。在确定可行性的基础上,优化了乳胶微球与抗体偶联时的封闭剂、形成DNAzyme过程中酶链和底物链的添加量、上样体系中反应液的添加量。得出最佳的实验方案,并在最佳方案下检测侧向层析试纸对铅离子的特异性和灵敏度。最终本章所利用的方法可以在5 min内完成对铅离子含量的检测,肉眼观察纸基分析装置的灵敏度为2 ppb,标准曲线的线性范围为0-8 ppb。(2)基于HRP催化的显色法对铅离子检测方法的建立本方法将铅离子可以特异性切割的DNAzyme与辣根过氧化物酶(Horse radish peroxidase,HRP)催化四甲基联苯胺(Tetramethylbenzidine,TMB)相结合。制备地高辛(Digoxin,DIG)抗体与磁性纳米粒子的偶联物,DIG和生物素修饰的DNAzyme。通过DIG与DIG抗体的特异性结合将DNAzyme连接在磁性纳米粒子上,通过生物素与SAV的特异性结合将HRP连接在DNAzyme上。铅离子切割以后,通过上清液催化TMB显色观察溶液颜色来判断溶液中铅离子的存在情况。此外,利用紫外分光光度计对上述溶液进行TMB吸光度的测定,通过吸光度数值对铅离子进行定量分析。并在可行性研究的基础上优化抗体的添加量、DIG抗体-MNPs的添加量、SAV-HRP的添加量及反应时间。得出最佳实验方案,并检测实验特异性和灵敏度。在最佳的实验条件下,肉眼可观察灵敏度为0.1 ppb,标准曲线的检测范围是0.1-10 ppb。(3)基于电化学传感器对铅离子检测方法的建立本方法将铅离子可以特异性切割的DNAzyme与电化学相结合,利用将探针固定在工作电极上,将反应过的DNAzyme溶液滴加到工作电极上与探针互补配对,利用SAV与金纳米粒子的表面偶联,再将标记有二茂铁的扩增产物滴加到工作电极上。利用电化学工作站观察电化学信号来判断溶液里铅离子的存在情况,也可以根据电化学信号的强弱来对铅离子进行定量分析。在可行性研究的基础上,优化LP1的浓度、MCH的封闭时间、SAV的添加量、LP2与HP扩增产物的反应时间。在最佳的条件下,标准曲线的检测范围为0.01-10 ppb。
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