论文部分内容阅读
目的:多囊卵巢综合征（PCOS）是一种常见的生殖与代谢紊乱的女性内分泌疾病,其病因尚不清楚,治疗方法也不尽人意。多囊卵巢综合征患者通常表现出胰岛素抵抗（IR）和高雄激素血症,增加了患心脏病、糖尿病和子宫内膜癌的风险。虽然并非所有多囊卵巢综合征患者都会出现胰岛素抵抗,但血脂异常与胰岛素抵抗显著相关。PCOS是一种慢性低度炎症状态,目前已有大量文献证明,持续的低度炎症在该疾病的代谢异常和卵巢功能障碍的发展中起着重要作用。值得注意的是,多囊卵巢综合征高雄激素血症和炎症之间存在着强烈的相关性,但具体机制不详。羧肽酶X,M14家族成员1（CPXM1）,是一种参与卵泡闭锁、胰岛素生成和脂肪组织生成的蛋白质。CPXM1对脂肪生成起着促进作用,并可能通过影响细胞外基质重塑在增生性脂肪组织扩张中发挥作用,而CPXM1在调节卵巢卵泡发育中起着抑制作用,但它在PCOS中的作用机制尚不清晰。本研究旨在探究CPXM1在PCOS发病中的作用及其机制。方法:在体内,建立多囊卵巢综合征小鼠模型,以了解CPXM1在雌性小鼠多囊卵巢综合征中的作用。从重庆医科大学动物研究中心购买了3周龄的雌性C57BL/6J小鼠,将小鼠随机分为两组,对照组n=20,PCOS组n=20。每天对每只小鼠进行处理,连续20天。对照组小鼠每日皮下注射芝麻油（0.1毫升）。PCOS组小鼠每天皮下注射6毫克DHEA,每100克体重溶解在0.1毫升芝麻油中。对照组给予正常的周粮。多囊卵巢综合征组给与高脂喂养。检测正常和多囊卵巢综合征小鼠血清激素水平,研究血清CPXM1与血清睾酮和胰岛素的相关性。采用免疫组织化学和免疫印迹法检测CPXM1在正常卵巢和PCOS卵巢中的定位和表达。采用免疫印迹法和实时定量聚合酶链反应（q PCR）检测正常组和PCOS组卵巢和脂肪组织中CPXM1的蛋白和m RNA表达。免疫印迹法检测正常组和PCOS组卵巢和脂肪组织中GLUT4和p-Akt/t-Akt蛋白的表达。q PCR检测正常卵巢和PCOS卵巢和脂肪组织中GLUT4、IRS-1、IRS-2和INSR的m RNA表达。对正常和PCOS小鼠的脂肪组织进行H＆E染色,以确定脂肪细胞的直径。观察血脂谱,以检测正常和PCOS小鼠血清中的血清TC、血清TG、血清HLD-C和血清LDL-C浓度。两组的血清TC、血清TG、血清HDL-C和血清LDL-C均检测到血清CPXM1的相关性。采用实时定量聚合酶链反应（q PCR）检测正常和PCOS卵巢和脂肪组织中TNF-α、IL-6、IFN-α、IFN-β和IFN-γ等炎性细胞因子的m RNA表达。建立体外细胞实验模型,通过使用慢病毒研究CPXM1的作用及其在卵巢颗粒细胞系（KGN）的过表达效率。进行RNA测序,研究正常组和过表达组的m RNA表达情况。采用q PCR、免疫印迹和免疫荧光法检测正常培养条件下两组KGN细胞的m RNA和蛋白水平以及CPXM1的蛋白表达。免疫印迹法检测正常组和LV-CPXM1组GLUT4和p-Akt/t-Akt蛋白的表达。Real-time q PCR用于检测正常组和LV-CPXM1组GLUT4、IRS-1、IRS-2和INSR的m RNA水平。流式细胞仪、免疫印迹和实时定量PCR检测两组KGN细胞的凋亡和增殖率。结果:本研究结果显示,PCOS小鼠血清CPXM1浓度、血清睾酮和胰岛素水平均较正常组显著增高,并且CPXM1浓度与血清睾酮和胰岛素水平呈正相关。卵巢的IHC结果显示,CPXM1在PCOS小鼠卵巢的髓质、GCs和卵母细胞中表达增加,可能直接影响到PCOS小鼠的卵巢功能。与正常卵巢相比,PCOS小鼠卵巢和脂肪组织中CPXM1的蛋白质和m RNA水平显著上调,GLUT4蛋白和m RNA水平明显下降,IRS-1和IRS-2 m RNA水平也明显下降,p-Akt蛋白表达在PCOS小鼠的卵巢和脂肪组织中也明显下降,表明PCOS中胰岛素刺激的葡萄糖摄取信号通路受到干扰,肥胖可能引起的胰岛素抵抗。与对照组相比,PCOS小鼠血清中的TC、TG、LDL-C水平都明显升高。血清CPXM1与TC、TG、LDL-C的浓度呈正相关。与对照组小鼠相比,PCOS小鼠的脂肪细胞直径和体脂率明显升高,表明出PCOS小鼠饮食诱导的可能导致肥胖和脂肪细胞肥大。此外,PCOS小鼠卵巢和脂肪组织中的炎症标志物如TNF-α、IL-6、IFN-α和IFN-γ的m RNA水平均显著增加,表明PCOS的促炎症状态。此外,此外,CPXM1的过表达导致葡萄糖代谢受损,导致胰岛素抵抗。LV-CPXM1组卵巢KGN细胞增殖率降低,凋亡率增加。此外,本研究的RNA-Seq结果显示许多重要基因m RNA表达水平发生改变,以及它们的相关功能和途径,这些基因在卵巢功能障碍、胰岛素抵抗和肥胖中起着重要作用,可能与多囊卵巢综合征的病理生理学有关。我们确定了与多囊卵巢综合征（PCOS）相关的CPXM1调节基因,如与卵巢功能障碍有关的基因（即Notch3、Camk2b、Tp53、Lif、Jun、Mmp2、Itga2、Itga7、Nos3、Elmo1、Dock1）、胰岛素抵抗和肥胖（即Ppp2r2b、Socs2、Gdap1、Gpc4）在LV-CPXM1组中,表明CPXM1上调在PCOS发病机制中的影响。结论:我们的研究结果首次表明,CPXM1的异常高表达、脂肪增加、糖耐量受损和慢性低度炎症可能在PCOS的病理生理学中共同作用于一个恶性循环。总的来说,我们的体内和体外研究结果检测到,CPXM1表达增加会导致PCOS中葡萄糖代谢受损和卵巢功能障碍。同时表明,CPXM1有可能成为治疗PCOS的一个潜在治疗目标。