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目的:白念珠菌耐药现象出现而导致念珠菌感染下降的治愈率引起越来越多人们的关注,而法尼醇可以增加多种微生物对药物的易感性。本研究探讨法尼醇对白念珠菌浮游状态和生物被膜状态对氟康唑药物的易感性影响;通过构建白念珠菌耐药株阐明法尼醇对白念珠菌标准株及耐药株生物被膜状态c AMP-PKA信号通路的调控作用及其与耐药的相关性。方法:实验一:实验分为法尼醇处理白念珠菌浮游组,生物被膜组以及各自法尼醇未处理对照组。采用XTT检测吸光光度值大小从而分析法尼醇处理对白念珠菌浮游状态和生物被膜状态对氟康唑药物易感性的差异。实验二:研究菌株为:白念珠菌标准株及利用白念珠菌标准株诱导的白念珠菌耐药株。实验分组如下:法尼醇处理白念珠菌标准株生物被膜,法尼醇未处理白念珠菌标准株生物被膜,法尼醇处理白念珠菌耐药株生物被膜及法尼醇未处理白念珠菌耐药株生物被膜组。提取白念珠菌生物被膜全RNA,实时荧光定量PCR(q-PCR)检测法尼醇对白念珠菌不同生物被膜时相c AMP-PKA信号通路相关基因Ras1,Gpa2,Cap1,Sgt1,Cyr1,Pde1,Pde2,Pka1,Bcy1,Tpk2,Efg1表达的调控作用;提取白念珠菌生物被膜蛋白质,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测法尼醇对c AMP-PKA通路RAS1,CYR1,PDE2,BCY1蛋白表达的作用。结果:实验一:XTT结果显示:浮游状态的白念珠菌对氟康唑的易感性是白念珠菌生物被膜状态的8~61倍(P<0.001)。同法尼醇未处理浮游状态白念珠菌相比,法尼醇处理后的浮游状态白念珠菌对氟康唑的敏感性无明显改变(P>0.05)。同法尼醇未处理生物被膜状态白念珠菌相比,法尼醇处理后生物被膜状态白念珠菌对氟康唑的敏感性增高(P<0.05)。实验二:q-PCR结果:法尼醇处理标准株组同法尼醇未处理标准株组比较:在生物被膜形成6 h,Ras1,Cap1,Sgt1,Cyr1,Pde1,Pka1,Bcy1,Tpk2,Efg1表达下调,Pde2表达上调,其余基因表达无明显改变;在12 h,Ras1基因表达下调,Cap1,Cyr1,Pde1,Pde2,Pka1,Bcy1,Tpk2基因表达上调,其余基因表达无明显改变;在24 h,Ras1,Cyr1基因表达下调,Pka1,Pde1,Pde2基因表达上调,其余基因表达无明显改变;在36 h,Ras1,Cyr1基因表达下调,Pka1基因表达上调,其他基因表达无明显改变。其中,法尼醇作用基因Ras1在生物被膜6 h,12 h,24 h和36 h表达均下调,Pde2在生物被膜6 h,12 h和24 h表达均上调,在生物被膜36 h表达没有明显改变,Cyr1在生物被膜6 h,24 h和36 h表达均下调,在生物被膜12 h表达上调(P<0.01)。法尼醇处理耐药株组同法尼醇未处理耐药株组比较:在生物被膜6 h,Ras1,Pka1,Bcy1,Tpk2表达下调,Cap1,Pde1,Pde2基因表达上调,其余基因无明显改变;在12 h,Ras1,Sgt1基因表达下调,Cyr1,Pde2,Pka1,Bcy1基因表达上调,其余基因无明显改变;在24 h,Ras1,Cap1基因表达下调,Pde1,Pde2,Bcy1基因表达上调,其余基因无明显改变.在36 h,Ras1,Cyr1,Pde2基因表达下调,Cap1,Pka1,Bcy1,Tpk2,Efg1基因表达上调,其余无基因明显改变。其中,法尼醇作用基因Ras1在生物被膜6 h,12 h,24 h和36 h表达均下调,Pde2在生物被膜6,12和24 h表达均上调,在生物被膜36 h表达下调,Cyr1在生物被膜12 h表达上调,在生物被膜36 h表达下调,在其余时间没有明显改变(P<0.01)。耐药株与标准株比较:在生物被膜6 h,Pde1,Pde2表达下调,Cyr1,Tpk2表达上调,其余基因无明显改变;在12 h,Pde1,Pde2基因表达下调,Cyr1,Tpk2基因表达上调,其余无基因明显改变;在24 h,Cyr1,Tpk2,Efg1基因表达上调,其余基因无明显改变;在36 h,Sgt1,Pde1,Pde2基因表达下调,Bcy1基因表达上调,其余基因无明显改变。其中,法尼醇作用基因Ras1在生物被膜6 h,12 h,24 h和36 h表达均无明显改变,Pde2在生物被膜6 h,12 h和36 h表达均上调,在生物被膜24 h表达无明显改变,Cyr1在生物被膜6 h,12 h和24 h表达上调,在生物被膜36 h表达没有明显改变(P<0.01)。Western Blot结果显示:法尼醇处理标准株组同法尼醇未处理标准株组比较:在生物被膜6 h,RAS1,CYR1,BCY1蛋白表达水平下调,PDE2蛋白表达水平上调;在12 h,RAS1表达水平下调,CYR1,PDE2,BCY1表达水平均上调;在24 h,RAS1 CYR1,PDE2,BCY1表达水平均下调;在36 h,RAS1 CYR1,PDE2,BCY1表达水平均下调。其中,法尼醇作用蛋白RAS1在生物被膜6 h,12 h,24 h和36 h表达均下调,PDE2在6 h和12 h表达上调,在24 h和36 h表达下调,CYR1在6 h,24 h和36 h表达下调,在12 h表达上调。法尼醇处理耐药株组同法尼醇未处理耐药株组比较:在生物被膜6 h,RAS1,CYR1,BCY1蛋白表达水平下调,PDE2蛋白表达水平上调;在12 h,RAS1表达水平下调,CYR1,PDE2,BCY1表达水平均上调;在24 h,RAS1 CYR1,PDE2,BCY1表达水平均下调;在36 h,RAS1 CYR1,PDE2,BCY1表达水平均下调。其中,法尼醇作用蛋白RAS1在生物被膜6 h,12 h,24 h和36 h表达均下调,PDE2在6 h和12 h表达上调,在24 h和36 h表达下调,CYR1在6 h,24 h和36 h表达下调,在12 h表达上调。耐药株组与标准株组比较:在生物被膜6 h,RAS1,BCY1,CYR1表达水平无明显改变,PDE2表达水平下调;在12 h,RAS1,BCY1,CYR1表达水平无明显改变,PDE2表达水平下调;在24 h,RAS1,BCY1,PDE2表达水平无明显改变,CYR1表达上调;在36 h,RAS1,BCY1,PDE2表达水平无明显改变,CYR1表达上调。其中,法尼醇作用蛋白RAS1在生物被膜6 h,12 h,24 h和36 h表达均无明显改变,PDE2在6 h和12 h表达下调,在24 h和36 h表达没有明显改变,CYR1在24 h和36 h表达上调,在6 h和12 h表达没有明显改变。结论:实验一:浮游状态下白念珠菌对氟康唑的药物易感性远高于生物被膜状态。法尼醇对浮游状态和生物被膜状态白念珠菌的药物易感性的作用不同:法尼醇未改变浮游状态白念珠菌对氟康唑的药物易感性;法尼醇增高了生物被膜状态的白念珠菌对氟康唑的药物易感性。实验二:法尼醇对白念珠菌生物被膜的调控作用与生物被膜形成时相相关,不同生物被膜时相法尼醇调控的基因蛋白及其表达存在差异。法尼醇可能通过调控c AMP-PKA信号通路耐药分子的表达影响白念珠菌生物被膜的耐药性。法尼醇对c AMP-PKA信号通路的调节作用是一个双向的,根据不同生物被膜时相,它的作用可以是正向调控也可以是负向调控。耐药株与标准株在c AMP-PKA信号通路表达结果有差异提示耐药株的出现可能是耐药分子的表达改变所导致。