红掌转录组测序及花青素生物合成途径差异表达基因的分析

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红掌(Anthurium andreanum)作为具有重要经济价值的盆花、切花种类。以佛焰苞为主要观赏部位,其颜色是决定商品价值的最重要因素。传统的杂交育种方式耗时长、后代变异大,选种困难;利用诱变育种,获得变异植株概率小,很难得到变异后代;分子育种是培育新品种的新方法,但因目前对红掌分子研究背景缺乏,分子方面研究相对滞后。为提高红掌选育效率,有必要建立红掌性状控制的分子遗传学基础,因此建立红掌基因组数据库意义重大。本研究采用新一代高通量Illumina HiSeq/MiSeq测序方法对红掌8个连续生长期(S1-S8)做转录组测序,并对S5(盛花期:红色)和S8(衰老期:绿色)时期分别做数字基因表达谱(DGE)测序,丰富了红掌转录组数据库信息,获得控制红掌佛焰苞花青素生物合成途径中颜色变化的关键基因。为后续功能基因克隆、分子标记筛选以及基因改良育种等提供了背景参考。具体研究结果如下:1、对红掌佛焰苞整个生长周期进行转录组测序得到有效基因序列(clean reads)56445573条,数据量达5.64 G,并得到长度分布在200-2000 bp的单基因簇(unigene)64576条,丰富了红掌转录组数据信息。2、对S5(盛花期:红色)和S8(衰老期:绿色)时期进行数字基因表达谱测序,分别得到12766374条(1.28 G)和18583390条(1.86 G)可分析序列(clean reads),其中被成功注释有差异表达的基因序列2316条。3、转录组结合数字基因表达谱测序,得到了在S5和S8两个时期差异表达的10条与花青素生物代谢途经有关的基因序列,通过NCBI比对,10条序列确定为8种基因,分别为查耳酮合成酶(CHS)、查耳酮异构酶(CHI)、黄烷酮-3β-羟化酶(F3H)、类黄酮3’-羟化酶(F3H)、二氢黄酮醇还原酶(DFR)、花色苷合酶(ANS)、无色花色苷还原酶(LAR)和肉桂酸-4-羟化酶(C4H),推测这10条基因序列在红掌佛焰苞颜色变化过程中起着关键作用。4、得到10条基因序列的特异扩增产物,通过qRT-PCR与DGE相互验证得到,该10条序列基因表达量均在S8中下调,与DGE测序结果趋势一致,证明了测序结果的准确性。5、通过监测10条基因序列在红掌佛焰苞整个生长周期的表达量变化,得到S3时期是红掌佛焰苞花青素合成的高峰期;在S5、S6、S7和S8时期,随着佛焰苞的成熟,10条序列表达量均逐渐下降,在S8衰老期10条基因序列的表达量达到最低。这10条基因序列是红掌佛焰苞花色形成中的关键基因。
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