小干扰RNA抑制巨噬细胞游走抑制因子的表达对胃癌AGS细胞增殖的抑制作用

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目的:巨噬细胞游走抑制因子(MIF)是一种多功能细胞因子,与肿瘤的发生有着密切的关系。本研究通过转染靶向MIF基因的小干扰RNA(RNA,siRNA),探讨MIF基因沉默后对胃癌AGS细胞增殖的影响。 方法:选取90例胃癌组织标本和78例癌旁正常组织标本制作成组织芯片,然后用免疫组化(IHC)分析MIF在胃癌患者中的表达,结合肿瘤的临床病理学资料,分析它们之间的相关性。设计并合成了针对MIF不同位点的2对siRNA序列(MIF si-1和MIF si—2)和1对无任何靶基因的siRNA做为阴性对照(NC),用脂质体Oligofectamine TM转染胃癌AGS细胞以沉默MIF基因,另设一组(Mock组)只加脂质体而无siRNA为对照组,以RT—PCR和Western blot分别检测24h、48h和72h中MIF mRNA和蛋白的表达;通过噻唑蓝(MTT)比色法、平板克隆实验和PCNA表达分析MIF沉默对胃癌AGS细胞增殖的影响;将AGS细胞用5-氟尿嘧啶(5-FU)处理24h后,转染siRNA,24h后收集细胞做Western blot,检测MIF和PCNA蛋白水平。 结果:组织芯片用免疫组化分析后显示胃癌组织MIF表达水平高于癌旁正常组织(P<0.001);在胃癌组织中有淋巴结转移(N1)MIF表达水平比无淋巴结转移(NO)的高(P=0.043)。AGS细胞转染MIF si-1、MIF si—2和NC比较,24h、48h、72h的MIF mRNA抑制率分别为为MIF si-162.83%、67.28%和76.91%,MIF si—256.65%、65.78%和73.86%;MIF蛋白抑制率为MIF si-171.00%、72.73%和76.51%,MIF si—262.94%、66.21%和73.55%。用RNA干扰沉默MIF基因后,MTT实验结果显示MIFsi-1和MIF si—2转染4天后细胞数分别为原来2.55±0.13倍和2.62±0.15倍,倍增时间分别为2.58±0.14天和2.42±0.17天,而NC组和Mock组细胞数则为原来的4.21±0.32倍和4.33±0.48倍,倍增时间分别为1.25±0.06天和1.08±0.14天。平板克隆实验结果显示经MIF si-1和MIF si—2沉默MIF基因10天后,AGS细胞集落形成数为33.15±4.12个和43.25±2.63个,显著低于阴性对照组的103.27±2.80个和未转染组(Mock组)的112.50±2.10个(均P<0.001)。同时,MIF沉默后,PCNA表达下调。AGS细胞用5-FU处理后,MIF表达水平比未处理的要高(灰度值47.51 vs40.80);再分别对5-FU处理细胞行RNA干扰,对MIF基因表达的抑制率MIF si-1为65.83%和MIF si—2为61.97%:同时经5-FU处理的AGS细胞PCNA表达下调。 结论:MIF在胃癌组织中高表达,且与其临床分期有关;沉默MIF基因后能抑制胃癌细胞AGS的增殖;MIF可能通过作用于胃癌干细胞样细胞进而调节胃癌细胞AGS的增殖。
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