【摘 要】
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目的：
胰岛移植是治疗糖尿病的理想手段,而胰岛细胞分离、纯化的数量及质量成为胰岛移植成功的关键所在。影响因素包括移植早期供胰岛缺血缺氧损伤、氧化应激,胰岛入血后
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目的：
胰岛移植是治疗糖尿病的理想手段,而胰岛细胞分离、纯化的数量及质量成为胰岛移植成功的关键所在。影响因素包括移植早期供胰岛缺血缺氧损伤、氧化应激,胰岛入血后即刻发生的血液介导的炎性反应以及免疫攻击等。其中,缺血时间一直被认为是最重要的因素之一。众多研究普遍认为,热缺血时间超过30分钟,对大鼠胰岛分离纯化可产生明显影响,不宜用于胰岛移植。本实验研究在体外应用Exendin-4与热缺血胰岛细胞培养,观察Exendin-4是否能够减少热缺血诱导胰岛β细胞的凋亡,促进胰岛β细胞增殖,改善胰岛功能,针对胰岛移植早期缺血的边缘供体如何处理提供有效方法。
材料与方法：
一、材料；
普通级封闭群Wistar大鼠,雌雄,体重250-280g。鼠显微手术器械,超净手术台,0.22um除菌滤器,电热恒温水浴箱(DHW-600),多功能振荡器,电子天平,微量加样器,荧光倒置显微镜(Olympus),高速离心机(TDL-5A),CO2细胞培养箱(Thermo)。胶原酶V型,Hanks液,Ficoll-400,丫啶橙(AO),溴乙啶(EB);RPMI-1640培养液,Exendin-4。
二、方法：
(一)大鼠热缺血模型的建立。
大鼠秤重后,腹腔注射麻醉。腹部正中切口进腹。剪开膈肌,用血管钳夹闭心脏基底部致使心脏停搏,阻断胸主动脉,造成心死亡供体(DCD)的热缺血模型。
(二)大鼠胰岛的分离和纯化。
采用明尼苏达大学改良法分离、纯化大鼠胰岛。胶原酶V原位灌注胰腺,快速切取,水浴消化。再经80目不锈钢筛网过滤、离心。然后采用Ficoll不连续密度梯度离心纯化胰岛。
(三)胰岛培养及分组。
根据实验条件随机分为三组(n=6):第一组热缺血0分钟组:对照组(热缺血0分钟胰岛细胞培养24h);实验组(10nmol/Lex-4与热缺血0分钟胰岛细胞培养24h);第二组热缺血30分钟组:对照组(热缺血30分钟胰岛细胞培养24h);实验组(10nmol/LEx-4与热缺血30分钟胰岛细胞培养24h);第三组热缺血45分钟组:对照组(热缺血45分钟胰岛细胞培养24h);实验组(10nmol/LEx-4与热缺血45分钟胰岛细胞培养24h)。在RPMI-1640完全培养基中培养24h。培养条件为:37℃,5％二氧化碳,95％空气。
三、观察指标；
应用双硫踪(DTZ)染色来计算分离胰岛数目并判断所提胰岛的纯度;丫啶橙/嗅乙啶(AO/EB)荧光染色法显示胰岛细胞活率;体外葡萄糖刺激下胰岛素释放试验。
四、统计学分析；
使用SPSS17.0统计软件对实验结果进行统计学分析,数据以均值±标准差(-x±s)表示,采用方差分析和t检验,P＜0.05为有统计学差异。
结果：
随着热缺血时间的延长各组获得胰岛的数量、纯度、存活率及功能逐渐降低。热缺血0分钟、30分钟、45分钟组加入10nmol/LEx-4培养24h后分离、纯化的胰岛数量及纯度、活性均比未加入Ex-4培养组有所提高,热缺血0分钟组加入10nmol/LExendin-4的实验组与对照组相比差异无显著性(P＞0.05),而热缺血30分钟组及热缺血45分钟组加入10nmol/LExendin-4的实验组与未加入10nmol/LExendin-4的对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。
结论：
1、Exendin-4对不同热缺血时间心死亡供体大鼠胰岛细胞具有保护作用,减少胰岛细胞凋亡,改善胰岛的存活与功能。
2、Exendin-4的使用可能成为胰岛移植早期缺血的边缘供体的预处理的有效方法。
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