烷化剂作用于细胞DNA,产生O~6-烷基鸟嘌呤,引起DNA损伤,杀伤细胞。而肿瘤细胞内的O~6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)能够参与修复肿瘤细胞的DNA烷化损伤,使肿瘤细胞对亚硝脲类烷化剂产生耐药性,是降低烷化剂药物对肿瘤细胞杀灭效应的关键因素之一,这是许多肿瘤细胞对亚硝脲类烷化剂耐药的分子基础。为了提高肿瘤细胞对烷化剂药物的敏感性,Kreklau等使用抑制剂抑制肿瘤细胞中MGMT的活性。但是使用抑制剂后,外周血单核细胞MGMT的活性受到抑制。其抑制作用是免疫反应性,长期的蓄积会导致骨髓毒性。Yoshinaga等曾报道用反义核酸技术、核酶技术抑制MGMT基因的表达,可以逆转肿瘤细胞对烷化剂的耐药性,但效应较低,选择序列比较盲目。近年来,RNA干扰成为最有效的基因沉默方式,siRNA具有特殊的双链互补RNA结构,尤其siRNA真核表达载体,可以在细胞内较长时间发挥作用,比反义RNA稳定,siRNA较之反义RNA技术及核酶具有独特的、可能更理想的基因表达调控效果,应用前景广阔。为了比较不同靶序列的RNAi作用,本研究首先合成3条编码发夹siRNA序列的单链DNA,克隆到pRNATin-H1.2/Neo载体H1.2启动子的下游,构建成含目的基因片段的重组质粒pRNATin- H1.2/NeoMGMT siRNA,以脂质体Lipofectimine 2000为介质转染人宫颈癌HeLa S3细胞,利用半定量RT-PCR,实时定量RT-PCR检测MGMT基因的抑制作用,采用MTT法,测定siRNA真核表达载体转染前后HeLa S3对烷化剂BCNU的敏感性变化,从而为利用RNA干扰提高肿瘤细胞对烷化剂的敏感性提供初步的实验证据。主要结果如下:1、成功构建siRNA真核表达载体pRNATin-H1.2/NeoMGMT siRNA,重组质粒转化后得到阳性克隆,抽提质粒,经PCR扩增,在2%琼脂糖凝胶电泳结果显示:PCR产物大小210bp,产物大小与设计的完全相同。测序结果证明序列正确。2、转染后HeLa S3细胞的GFP表达:在倒置荧光显微镜下观察,经LipofectimineTM2000转染的HeLa S3细胞在转染后48h,在荧光显微镜下可见细胞呈现